幽門螺桿菌活載體疫苗的研究進(jìn)展＊

羅夙醫(yī),吳利先

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H P)被公認(rèn)為是慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍等疾病發(fā)生的主要病因,并與胃腺癌、胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),是一級(jí)致癌因子[1]。雖然H P確切的致病機(jī)制尚未完全闡明,但H P必須首先定植于胃粘膜,然后再進(jìn)一步侵入宿主防御系統(tǒng),由其毒素的直接作用和誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等間接作用損傷組織而致病。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,我國(guó)幽門螺旋桿菌感染率約為40%～60%,兒童也有相當(dāng)高的感染率。雖然聯(lián)合化學(xué)藥物治療對(duì)H P感染可取得較好的根除率,但也存在菌株耐藥、藥物副反應(yīng)、價(jià)格昂貴等問題,難以推廣。因此,人們期待H P疫苗的早日問世。很多實(shí)驗(yàn)證明,減毒菌株能有效激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。將限制性突變引入減毒菌,可使其變得更安全,所以減毒胞內(nèi)菌已被許多科研工作者用作載體攜帶外源抗原,即活載體疫苗[2]。接種這種重組活疫苗后,能同時(shí)獲得對(duì)病原體本身的防御作用和異源抗原的特異性免疫應(yīng)答。因此,在使用多種疫苗載體攜帶抗原激起黏膜免疫途徑的方法中,活菌作為疫苗載體具有相當(dāng)好的應(yīng)用和開發(fā)前景。下面就H P活載體疫苗的研究近況進(jìn)行綜述。

1 減毒沙門菌作為活載體的疫苗

減毒沙門氏菌是最早用做活疫苗載體的病原菌之一,也是目前研究最深入的活菌疫苗載體。最適合表達(dá)異源性抗原的是鼠傷寒沙門氏菌。它在人體內(nèi)的感染局限于腸黏膜,但在小鼠體內(nèi)可以廣泛感染。減毒沙門氏菌載體的構(gòu)建策略是使致病基因缺失,然后將外源基因整合到沙門氏菌染色體的特定部位。構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌活載體減毒株,均是兩個(gè)或多個(gè)基因的精確突變,其基因型和表型均很穩(wěn)定。

我國(guó)陳旻湖等[3]成功構(gòu)建了表達(dá)幽門螺桿菌(H P)過(guò)氧化氫酶(Kath)的減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株,并將此減毒鼠傷寒沙門氏菌疫苗株經(jīng)口服接種C57BL/6小鼠,再用H P悉尼株(SS1)進(jìn)行攻擊,然后對(duì)胃組織標(biāo)本進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)和細(xì)菌定量培養(yǎng),結(jié)果均顯示,該疫苗株具有防御感染的作用,特別是以3×108CFU/只的菌量接種時(shí)獲得的效果最佳,提示重組減毒沙門氏菌疫苗株在動(dòng)物體內(nèi)能夠誘導(dǎo)出抗H P保護(hù)性免疫效應(yīng)。隨后他們還構(gòu)建了表達(dá)尿素酶B亞單位(UreB)與血溶素 E(hlyE)融合蛋白的減毒沙門疫苗菌也取得了同樣的效果[4]。Xu等[5]構(gòu)建了共表達(dá)幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和小鼠IL-2的減毒傷寒沙門氏菌活載體疫苗,通過(guò)Western blot證實(shí)此融合蛋白具有免疫原性。通過(guò)小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)此融合基因活載體疫苗具有抗幽門螺桿菌感染的作用。Sun等[6]構(gòu)建了表達(dá)幽門螺桿菌中性粒激活蛋白(napA)的減毒沙門氏菌活載體疫苗,也通過(guò)Western blot證實(shí)了此疫苗表達(dá)的中性粒激活蛋白具有抗原性。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)此疫苗具有免疫原性。此外,還有減毒鼠傷寒沙門氏菌作為載體,表達(dá)螺桿菌粘附素基因HpaA,尿素酶A亞單位為靶基因的活載體疫苗報(bào)道[7-8]。

減毒沙門菌載體疫苗免疫簡(jiǎn)單易行,一次口服免疫可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫保護(hù)反應(yīng),有利于大規(guī)模接種,且減毒沙門菌既是外源抗原的載體又可作為疫苗佐劑;以減毒沙門菌載體疫苗免疫具有持續(xù)性和多聯(lián)性,能激發(fā)比較全面的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫反應(yīng),其抗原遞呈效率高于以往其他的DNA疫苗。但制備疫苗用菌株仍存在微弱的致病性。

2 乳酸菌為活載體的疫苗

乳酸菌(lactis acid bacteria,L AB)被公認(rèn)為安全級(jí)(generaly recognized as safe,GRAS)微生物。廣泛分布于環(huán)境,特別是動(dòng)物的消化道、尿道,蔬菜和食品中,具有調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防或緩解胃腸道疾患、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、減少心血管病發(fā)病率、降低與酒精中毒性肝病相關(guān)的內(nèi)毒素作用等有益于人體健康的諸多生理功能[9]。

有研究表明,乳酸桿菌可以某種免疫調(diào)節(jié)因子的形式起作用,刺激胃腸道某種局部型免疫反應(yīng)。說(shuō)明乳酸桿菌不僅可以預(yù)防和治療H P感染,還可抑制其他致病菌的生長(zhǎng),同時(shí)不會(huì)對(duì)胃酸過(guò)度抑制,故以乳酸桿菌為主的微生態(tài)制劑可能成為一種安全、有效的治療H P感染的方法。同時(shí)也可能成為一個(gè)較理想的H P疫苗的載體。

我國(guó)孫振璐等[10]將H P的alpA基因克隆至表達(dá)載體pNICE:sec,并將其轉(zhuǎn)化入乳酸菌NZ9000株,在乳酸菌中成功表達(dá)了H P的黏附素alpA蛋白。Western blot顯示alpA蛋白具有良好的免疫原性。將表達(dá)alpA蛋白的乳酸菌NZ9000株免疫小鼠后有抗體產(chǎn)生,說(shuō)明表達(dá)alpA蛋白的乳酸菌口服免疫小鼠后,有防御幽門螺桿菌感染的作用。李建芳等[11]將 napA基因克隆到乳酸菌表達(dá)質(zhì)粒pNICE:sec,在乳酸菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。經(jīng)活菌灌胃免疫小鼠,實(shí)驗(yàn)證明獲得的活載體疫苗對(duì)小鼠有保護(hù)作用。于文等[12]在以幽門螺桿菌尿素通道蛋白u(yù)reI和外膜脂蛋白lpp20為目的基因,分別構(gòu)建了乳酸乳球菌表達(dá)重組載體 PNZ8112/ureI和PNZ8112/lpp20。該攜帶質(zhì)粒的活菌在傳代二十代后其質(zhì)粒未丟失,證明該重組質(zhì)粒具有良好的穩(wěn)定性,為進(jìn)一步研究其免疫保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。龔芳紅等[13]構(gòu)建了含H P熱休克蛋白A(HspA)編碼基因的重組載體,并電轉(zhuǎn)化入乳酸球菌MG1363,表達(dá)目的蛋白并分析其免疫原性,成功構(gòu)建了表達(dá)H PHspA的重組乳酸乳球菌 MG1363。朱麗芳等[14]構(gòu)建高效表達(dá)幽門螺桿菌黏附素H P0410的嗜酸乳桿菌重組菌株,也成功構(gòu)建了高效表達(dá)H P0410的重組嗜酸乳桿菌菌株。

3 分枝桿菌為活載體的疫苗

卡介苗(Bacille Calmette-Guérin,BCG)一度認(rèn)為是理想的重組活載體疫苗。但近10年的研究表明,BCG有諸多不足:難于培養(yǎng),對(duì)多種抗生素有抗藥性,轉(zhuǎn)化率低,對(duì)于免疫力低下者,有可能誘發(fā)致命的結(jié)核病,許多學(xué)者轉(zhuǎn)向非致病分枝桿菌作為載體的研究。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis,MS)是一類快速生長(zhǎng)型分枝桿菌,生長(zhǎng)快,1～3h繁殖1代,MS既是一種非致病菌又是一種細(xì)胞免疫佐劑,很多外源蛋白能在MS中表達(dá)。我國(guó)向廷秀等[15-16]選擇H P兩個(gè)保守基因 UreB和OMP18分別克隆入大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體中,利用電穿孔法將表達(dá)載體導(dǎo)入MS中,然后將重組候選疫苗株單獨(dú)或聯(lián)合灌胃免疫BALB/c小鼠。攻擊后4w,取血清、胃、脾組織,RT-PCR檢測(cè)小鼠胃粘膜和脾組織的 Th1細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2、IL-12)與 Th2 細(xì)胞因子 (IL-4、IL-6、IL-10);ELISA檢測(cè)H P特異性血清 IgG,IgG1,IgG2a和IgA水平;免疫組化方法檢測(cè)胃黏膜固有層IgA表達(dá);MTT檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖。提示該疫苗的作用機(jī)制是誘導(dǎo) Th1/Th2平衡型免疫應(yīng)答。徐永柱等[17]構(gòu)建了UreB基因質(zhì)粒pLUB大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質(zhì)粒和重組恥垢分枝桿菌疫苗,重組MS疫苗經(jīng)灌胃接種BALB/c小鼠能降低H P定植,減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng),對(duì)H P感染有明顯的預(yù)防保護(hù)作用。呂琳等將H P外膜蛋白Omp26基因克隆入大腸桿菌一分枝桿菌穿梭表達(dá)載體中,用與向廷秀相同的方法獲得了活載體疫苗。用活菌免疫小鼠后再用幽門菌攻擊小鼠,結(jié)果顯示,rMs治療性疫苗不僅能明顯減少小鼠胃粘膜H P數(shù)量,甚至可根除胃內(nèi)H P的感染,而且能減輕胃黏膜的局部炎癥反應(yīng),能產(chǎn)生以 Thl細(xì)胞和 Th2細(xì)胞反應(yīng)協(xié)同作用的保護(hù)性免疫應(yīng)答。隨后他們又構(gòu)建了幽門螺桿菌尿素通道蛋白UreI基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒,并在恥垢分枝桿菌中獲得表達(dá)[18]。然而不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、不同的免疫途徑、不同的疫苗載體可產(chǎn)生不同的免疫效果,免疫機(jī)制也有所不同,需進(jìn)一步對(duì)感染機(jī)制及疫苗保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究。

MS與固有免疫抗結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium.tuberculosis,Mtb)都是胞內(nèi)寄生菌,進(jìn)入機(jī)體被巨噬細(xì)胞吞噬,具有一定的靶向性。MS具有較強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫佐劑作用。MS經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)改造后,作為外源基因的表達(dá)或遞送載體。與其他載體相比,具有良好的安性、靶向性和易控性,價(jià)格低廉,易于推廣。恥垢分枝桿菌不能在巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活,從基因治療的角度出發(fā),單位細(xì)胞內(nèi)攝入的重組MS數(shù)量越多,則通過(guò)該菌苗帶入巨噬細(xì)胞內(nèi)的基因治療性質(zhì)粒的拷貝數(shù)越多,對(duì)于表達(dá) GLS和IL-12就越有利。

4 以雙歧桿菌為活載體

雙歧桿菌是存在于人體腸道內(nèi)一種非常重要的益生菌,能代謝產(chǎn)生多種活性物質(zhì)。研究表明,雙歧桿菌對(duì)人類的健康起著重要的作用,不僅可治療腸道菌群失調(diào)、抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、輔助治療多種疾病,還具有抗輻射和作為基因治療轉(zhuǎn)移載體、抑制腫瘤等多種功效。

雙歧桿菌做載體在寄生蟲和腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用比較多。用在幽門桿菌疫苗方面較少,但應(yīng)該也是一種較為可行的載體,本課題組正致力于此方面的研究。

5 其它的 HP疫苗載體

其它的活載體疫苗有病毒載體疫苗、自載體疫苗。Novak等[19]曾將H P脲酶亞單位基因插入減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因中,代替部分脊髓灰質(zhì)炎病毒使小鼠產(chǎn)生抗H P脲酶亞單位的IgG抗體,并且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生 IFN-γ和 IL-4。以病毒作為疫苗傳遞載體的研究為近年來(lái)興起,但作為H P疫苗的載體研究報(bào)道較少,研究范圍和深度尚待進(jìn)一步加強(qiáng)。1999年 Panthel等[20]通過(guò) PhiX174基因 E介導(dǎo)的細(xì)菌溶解機(jī)制,使H P變?yōu)橐粋€(gè)細(xì)菌空殼,實(shí)現(xiàn)了一種新形式的幽門螺桿菌全菌疫苗,免疫小鼠能產(chǎn)生高效的局部和系統(tǒng)免疫反應(yīng),動(dòng)物試驗(yàn)中能夠有效根除感染的H P,亦能有效控制再次感染。

6 展 望

研究安全無(wú)毒、效果明顯、便于生產(chǎn)和應(yīng)用的疫苗是H P疫苗研究的最終目標(biāo),活載體疫苗具備了其他形式疫苗所不具有的眾多優(yōu)點(diǎn),必將在未來(lái)得到更加廣泛深入的研究,會(huì)成為H P疫苗未來(lái)的主要發(fā)展方向。幽門螺桿菌載體疫苗的發(fā)展將還有一段艱難的道路,特別是需要解決一系列關(guān)鍵技術(shù)。如目前免疫效果最好的減毒沙門菌載體疫苗,在志愿者試服過(guò)程中出現(xiàn)了較強(qiáng)烈的嘔吐、腹瀉等毒性反應(yīng),在廣泛人群中應(yīng)用的可能性還很小。技術(shù)最新的“細(xì)菌幽靈疫苗”,目前僅在實(shí)驗(yàn)室研究階段,缺乏大量的免疫、毒理及其他一系列保護(hù)性和安全性試驗(yàn)數(shù)據(jù).而且作為基因工程疫苗,同乳酸菌載體疫苗一樣,攜帶有轉(zhuǎn)基因成分的疫苗和載體疫苗不但要解決食品級(jí)疫苗改造的技術(shù)難關(guān),在安全性評(píng)價(jià)、工業(yè)化生產(chǎn)和群眾認(rèn)可度上也存在很多未知因素,需要進(jìn)一步探索和求證。

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