絲素蛋白在電紡絲法構(gòu)建組織工程支架中的應(yīng)用進展

陳玲，竺亞斌，李媛媛，劉玉新，俞珺瑤

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211

絲素蛋白在電紡絲法構(gòu)建組織工程支架中的應(yīng)用進展

陳玲，竺亞斌，李媛媛，劉玉新，俞珺瑤

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211

絲素蛋白是天然高分子纖維蛋白，具有良好的物理和機械力學(xué)性能及生物相容性，因而在組織工程領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。文中對絲素蛋白的化學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)特點、提取方法以及利用靜電紡絲技術(shù)在組織工程化支架構(gòu)建中的應(yīng)用作了概述?？偨Y(jié)了絲素蛋白在用于組織工程材料上的性能和優(yōu)勢以及在人工血管、皮膚、骨組織等工程化支架方面的應(yīng)用情況，探討了絲素蛋白支架對細(xì)胞在其上生長、增殖和功能的影響，同時對絲素蛋白在組織工程化食道支架及其他再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景進行了展望。

絲素蛋白，電紡絲，組織工程，支架構(gòu)建

1 絲素蛋白的性質(zhì)及制備

絲素蛋白，由蠶絲蛋白脫膠而得到，約占蠶絲總重量的75%。分子結(jié)構(gòu)上，絲素蛋白由輕、重兩條鏈構(gòu)成，分子量分別為25 kDa和325 kDa，兩條鏈緊緊纏繞，結(jié)構(gòu)致密，其空間結(jié)構(gòu)主要包括 3種構(gòu)象：無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-折疊。蛋白分子鏈按α-螺旋和β-平行折疊構(gòu)象交替堆積形成Ⅰ型結(jié)構(gòu)，按 β-反平行折疊堆積形成Ⅱ型結(jié)構(gòu)，這些分子鏈構(gòu)象與晶型結(jié)構(gòu)決定了絲素蛋白具有良好的力學(xué)性能[5]，使其在靜電高壓電場下容易被拉成纖維，而被用于電紡絲研究，并且它的分子量大、黏度高、分子構(gòu)象穩(wěn)定。據(jù)報道[6]，純絲素蛋白的抗拉強度為610~690 MPa，強度系數(shù)為15~17 GPa，斷裂伸長率為4%~16%，具有高度重復(fù)的丙氨酸-甘氨酸-絲氨酸序列，是一種無生理活性的天然結(jié)構(gòu)性蛋白，具有其他高分子材料所不可比擬的優(yōu)點：無毒、無刺激、無污染、獨特的機械性能及優(yōu)良的透氣性、透濕性和生物相容性，支持組織細(xì)胞的生長與增殖。而且絲素蛋白具有與其他生物大分子一樣的生物可降解性，這使其成為了組織工程器官和組織構(gòu)建中的新型材料[7-9]。目前正在研究開發(fā)的如人工皮膚、血管、免拆除手術(shù)縫合線、絲素膜、生物反應(yīng)器等產(chǎn)品已取得了突破性進展，有些已進入臨床應(yīng)用研究。

純絲素蛋白外邊包裹著膠狀的絲膠蛋白，要獲取純絲素蛋白首先要脫膠，傳統(tǒng)上的脫膠方法是把蠶繭或蠶絲以 1∶100 (W/W) 的比例放入 0.5% Na2CO3溶液里煮沸1 h，然后用去離子水反復(fù)清洗，直至膠狀物脫盡，即得絲素蛋白。

由于絲素蛋白分子的結(jié)構(gòu)存在很多結(jié)晶區(qū)，其分子構(gòu)象很穩(wěn)定，較難溶解成溶液狀態(tài)。目前絲素蛋白的溶解方法主要有以下幾種：

1) Ajisawa’s法[10]：把絲素蛋白以1∶15 (W/V)的比例放入 Ajisawa，s (氯化鈣/甲醇/水，111 g/92 g/144 g) 體系中，置于75 ℃水浴中，直至絲素蛋白完全溶解。

2) Ca(NO3)2·4H2O 溶解法：將脫膠蠶絲放入Ca(NO3)2·4H2O熔融體系中，加熱溶解。不同的溶解條件對最終所得的可溶性絲素蛋白的構(gòu)象和蛋白的裂解程度有較大影響。

3) LiSCN溶解法：把絲素蛋白以1∶30~1∶100 (W/V) 的比例加入9 mol/L的LiSCN溶液中，置于室溫直至溶解。

溶解后的絲素蛋白于去離子水中透析至鹽離子完全移除，在室溫、鼓風(fēng)烘箱、冷凍抽干機中分別制得室干膜、烘干膜及海綿狀冷凍膜。

我國是蠶絲生產(chǎn)大國，蠶絲的產(chǎn)量占全世界總產(chǎn)量的65%，如果能加以良好開發(fā)并實際應(yīng)用，相信將會產(chǎn)生很高的社會效益和經(jīng)濟效益。

2 絲素蛋白的電紡絲

自從Formhals等[11]在1934年利用電紡技術(shù)實現(xiàn)納米纖維無紡布的構(gòu)建之后，靜電紡絲技術(shù)就為大家所熟知。這一技術(shù)的核心是使帶電流體在靜電場中流動與變形，最終得到纖維狀物質(zhì)。當(dāng)給注射器針尖和收集板之間加上靜電高壓時，電場力克服針尖液滴的表面張力，高速射流被拉伸，然后形成泰勒錐，靜電力使射流分岔，變成極細(xì)的絲狀纖維。最后溶劑揮發(fā)，收集板收集到無序的無紡布式納米級纖維。

Zhu等[12]制備了再生絲素蛋白水溶液，使用靜電紡方法，在注射器針尖和收集板之間距離為20 cm，電壓40 kV，溶液濃度為30%的條件下，得到直徑在1 700 nm左右均勻的絲。使用水作為溶劑安全、可控，對培養(yǎng)細(xì)胞無毒副作用，移植入人體內(nèi)無排斥反應(yīng)。

Sukigara等[13-14]把絲素蛋白溶于甲酸制備電紡液，通過調(diào)節(jié)電紡參數(shù) (如電壓、流速、接收距離，射流角度等) 和絲素蛋白溶液的濃度，得到了直徑在12~1 500 nm范圍內(nèi)的纖維。如當(dāng)溶液濃度為12%~15%，距離為7 cm和10 cm，電壓為3 kV/cm和4 kV/cm時，得到了100 nm左右的均勻的纖維；經(jīng)過效應(yīng)面優(yōu)化法檢測，當(dāng)溶液濃度為8%~10%，距離為5 cm和7 cm，電壓為4 kV/cm和5 kV/cm時，得到了直徑在40 nm左右的電紡纖維，其抗斷強度為515 MPa，斷裂應(yīng)變?yōu)?.2%。

Jeong等[16]把絲素蛋白溶于六氟異丙醇(HFIP)制備電紡液，當(dāng)溶液濃度為7%，接收距離為8 cm，電壓為16 kV時，紡織出最優(yōu)化的無規(guī)則電紡布，但是經(jīng)過研究分析，單純由再生絲素蛋白制得的無紡布，其機械強度均比原始絲的機械強度有所降低。如電紡絲比自然蠶絲纖維的斷裂應(yīng)變小，主要原因是在處理過程中，改變了自然絲的部分原始結(jié)構(gòu)，影響了它的強度。因此也有人將絲素蛋白與其他高聚物共紡，以提高組織工程支架的機械強度。

McClure等[17]把絲素蛋白、聚己內(nèi)酯、聚二惡烷酮 (PDO) 溶于HFIP，然后按50∶50 (V/V) 的比例把絲素蛋白分別與聚己內(nèi)酯和聚二惡烷酮共混，使用滾軸為接收器，當(dāng)滾軸的轉(zhuǎn)速分別為500 r/min和8 000 r/min時，絲素蛋白-聚己內(nèi)酯共紡纖維的直徑分別在 (1.3±0.3) μm和 (0.9±0.4) μm范圍內(nèi)；絲素蛋白-聚二惡烷酮共紡纖維的直徑分別在(1.0±0.3) μm和 (1.0±0.2) μm范圍內(nèi)。當(dāng)接收器的轉(zhuǎn)速為500 r/min時，得到的纖維雜亂無序，而當(dāng)接收器的轉(zhuǎn)速為8 000 r/min時得到了有序排列的取向纖維。

Wang等[18]對傳統(tǒng)電紡進行了創(chuàng)新，他們用絲素蛋白與明膠 (Gelatin) 共混電紡作為管狀支架的內(nèi)層，再在管狀支架的外層電紡上一層聚乳酸，當(dāng)電壓為30 kV，接收距離為15 cm，流速為0.2 mL/h，接收器轉(zhuǎn)速為1 000 r/min時，內(nèi)層得到的纖維直徑范圍在 (139±42) nm 內(nèi)，孔隙率為(82±2)%。經(jīng)過力學(xué)性能測試，其抗斷強度為(2.21±0.18) MPa，延展率為 (60.58±1.23)%，爆破強度為 (1 596±20) mmHg。

由上述可知，要想得到適合結(jié)構(gòu)的支架可以通過調(diào)節(jié)電紡條件和電紡液參數(shù)來實現(xiàn)。絲素蛋白在不同條件下靜電紡絲得到的纖維直徑及其機械性能列于表1。

3 絲素蛋白電紡支架在組織工程上的應(yīng)用

利用靜電紡絲的方法重新構(gòu)絲，模擬細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞能粘附和增殖。目前對絲素蛋白用于組織工程支架材料的研究已得到廣泛的關(guān)注，在人工血管、皮膚、骨等諸多組織工程領(lǐng)域得到開發(fā)和應(yīng)用 (表2)。

3.1 人工血管

人體血管的結(jié)構(gòu)和功能極其復(fù)雜，電紡法制備的管狀支架擁有極高的孔隙率，纖維之間緊密連接，具有較強的抗爆能力，與人體血管的結(jié)構(gòu)相似，有利于血管支架的構(gòu)建。

Soffer等[19]利用絲素蛋白和聚氧乙烯 (PEO)作電紡液，制備了內(nèi)徑為 0.15 mm，彈性模量為(2.45±0.47) MPa，抗張強度為 (2.42±0.48) MPa，平均爆破壓為811 mmHg的血管支架，經(jīng)過在含內(nèi)皮生長因子-2的培養(yǎng)基中孵化一段時間后，人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞 (HCASMCs) 和人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs) 在其上生長良好。

Zhang等[20-21]以絲素蛋白和PEO為電紡液，以滾軸為接收器，制備了內(nèi)徑為3 mm的管狀血管支架，在其上培養(yǎng)人冠狀動脈平滑肌細(xì)胞 (HCASMCs)和人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HAECs)，5 d后，HCASMCs已由星狀結(jié)構(gòu)遷移為錘狀，10 d后，HCASMCs完全擴展，檢測得到細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平最高，而HAECs在14 d后最高，這些實驗證明了細(xì)胞在絲素蛋白支架上的生長、黏附、形態(tài)和增殖效果良好。

表1 電紡絲素蛋白纖維性能及其紡絲條件Table 1 Fibre properties of silk as a function of electrospinning parameters

表2 電紡絲素蛋白纖維在組織工程化支架構(gòu)建中的應(yīng)用Table 2 Object tissue and seeded cells of scaffolds fabricated from electrospun silk or silk complex

Zhang等[22]將絲素蛋白水溶液進行電紡，然后在其上種植髖動脈內(nèi)皮細(xì)胞 (PIECs)，電鏡圖顯示，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，PIECs在支架上粘附與鋪展良好，7 d以后，PIECs爬滿了整個支架，形成了一個內(nèi)皮組織層，這一實驗證明了絲素蛋白與血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的相容性，是制備人工血管的優(yōu)質(zhì)基質(zhì)材料之一。

3.2 人工皮膚

對皮膚組織工程支架的要求是能在盡量短的時間內(nèi)生產(chǎn)出能永久覆蓋的假體皮膚，并且將黑色素細(xì)胞和郎格罕氏細(xì)胞引入皮膚構(gòu)建，形成“真皮膚”。表皮干細(xì)胞具有產(chǎn)生皮膚附屬器的能力，在嚴(yán)重?zé)齻缕つw缺損時，這些干細(xì)胞能保留像胚胎細(xì)胞的多能性，是潛在的多能性細(xì)胞[23]。利用具有良好生物相容性的絲素蛋白為材料，使用電紡技術(shù)制備納米纖維多孔支架，種植多能性的“種子細(xì)胞”來生產(chǎn)更接近于實體皮膚的“人造皮膚”，具有良好的發(fā)展前景。

Min等[24-25]采用靜電紡技術(shù)制成的絲素納米纖維多孔支架，平均孔徑為 80 nm，在此材料上培養(yǎng)人體角質(zhì)細(xì)胞 (Human keratinocytes) 和成纖維細(xì)胞 (Fibroblasts) 效果良好。電鏡照片顯示，培養(yǎng)3 d后，角質(zhì)細(xì)胞在絲素納米纖維材料表面黏附生長，并沿孔擴散到內(nèi)層，且細(xì)胞之間以及細(xì)胞與周圍纖維之間作用良好；7 d后，細(xì)胞沿纖維方向生長并形成三維網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)胞層結(jié)構(gòu)。

Yeo等[26]把絲素蛋白和膠原 (Collagen) 按不同比例溶于 HFIP制備粘度為 (176±4)~(211±6) cP的電紡液，織出了纖維直徑為320~360 nm的多孔支架，然后在上邊種植人表皮角質(zhì)細(xì)胞 (NHEKs) 和成纖維細(xì)胞 (Fibroblasts)。種植1 d后，NHEK在膠原、絲素蛋白支架以及不同比例 (除50/50外) 的膠原和絲素蛋白的混合支架上，細(xì)胞粘附和生長良好。

Jeong等[16]用氧氣和甲烷對絲素蛋白支架表面進行改性并培養(yǎng)人表皮角質(zhì)細(xì)胞，數(shù)小時后，細(xì)胞黏附率很高，并且增殖和遷移態(tài)勢良好，可見這樣制備的支架符合皮膚組織工程的要求。

3.3 骨組織

基于絲素蛋白的韌性及電紡技術(shù)制備的纖維具有高孔隙率、高比表面積等特點，使用電紡技術(shù)和絲素蛋白作骨組織工程支架的研究日趨得到發(fā)展。

Meechaisue等[27]把絲素蛋白溶于甲酸，制備骨支架，在其上培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞 (Rat osteoblasts)，3 d后，細(xì)胞擴増面積明顯增大，細(xì)胞之間以及細(xì)胞與周圍纖維之間作用良好，5 d后，細(xì)胞完全把支架鋪滿，達(dá)到最大增殖率。利用生長因子刺激細(xì)胞偽足，可以指導(dǎo)細(xì)胞取向生長。

單純的絲素蛋白多孔支架作為骨組織工程支架，在機械強度上不能滿足要求。Li等[28]利用絲素蛋白與PEO和羥基磷灰石 (HAP) 共混，制備了多種支架，經(jīng)過比較，絲素蛋白與羥基磷灰石共紡的支架性能最優(yōu)，纖維直徑為 (590±60) nm，并在其上培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞，經(jīng)過骨成型蛋白-2(BMP-2) 的處理，細(xì)胞生長良好。

Meinel等[29]利用絲素蛋白和PEO水溶液共混電紡，得到了纖維直徑為 (530±100) nm的支架，然后種植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，72 h之后，細(xì)胞沿著軸向完全遷移，偽足明顯可見。

Park等[30]利用絲素蛋白制作納米級三維多孔支架，其直徑為6 mm，壁厚為1.5 mm。在支架上種植MC3T3-E1成骨細(xì)胞，經(jīng)過DNA計數(shù)和四甲基偶氮唑鹽比色法 (MTT)，分析細(xì)胞的增殖和新陳代謝能力，細(xì)胞生長良好，把支架移植入骨損傷的小鼠體內(nèi)，7 d后，小鼠的骨完全恢復(fù)。這說明絲素蛋白和電紡技術(shù)在骨組織工程研究和應(yīng)用上是有潛力的。

我們實驗室正致力于組織工程化食道的構(gòu)建，前期工作中對支持食道上皮細(xì)胞的基膜結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和蛋白質(zhì)組成進行了定性和定量分析，對可降解聚合物如PLA、PCL等多孔支架與食道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等的相互作用進行了研究。在這些實驗的基礎(chǔ)上，我們以絲素蛋白和可降解合成聚合物為基材，運用自行研制的靜電紡絲系統(tǒng)，構(gòu)建在宏觀外形和微觀結(jié)構(gòu)上模擬食道天然結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架[31-34]。如利用絲素蛋白和 PLA、PCL等混合共紡制備了系列電紡絲纖維，其纖維直徑在30~500 nm范圍內(nèi)，運用Instron力學(xué)分析系統(tǒng)，對其機械力學(xué)性能進行了測試分析。細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果，證明上述電紡絲纖維與食道原代上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性 (待發(fā)表)。

以上實驗均證明了絲素蛋白在以靜電紡絲技術(shù)制備組織工程支架方面具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。但是目前的研究僅限于實驗室和動物體內(nèi)，還未涉及人體試驗和臨床應(yīng)用。另一方面，在提取絲素蛋白時，不同的提取處理方法可能導(dǎo)致絲素蛋白構(gòu)象的改變，從而影響其物理和/或化學(xué)性能，進一步影響所構(gòu)建支架的機械力學(xué)性能、降解性或生物特性等，而這些方面的研究目前還未見詳細(xì)報道。

4 展望

絲素蛋白具有良好的生物相容性和可調(diào)控的生物降解性，在組織工程領(lǐng)域如皮膚、血管、食道等組織和器官的構(gòu)建具有廣闊的發(fā)展前景。以后的研究一方面應(yīng)對絲素蛋白的理化性質(zhì)及化學(xué)處理對其性質(zhì)的影響規(guī)律等內(nèi)容進行系統(tǒng)研究，以補充有關(guān)絲素蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的基礎(chǔ)知識；另一方面，全面了解絲素蛋白與組織工程領(lǐng)域中種子細(xì)胞如動物組織來源的原代細(xì)胞或干細(xì)胞的作用及生物學(xué)功能，并進一步深入研究細(xì)胞-材料復(fù)合支架的力學(xué)性能、降解性及動物體內(nèi)的功能性等，這些知識將為以后構(gòu)建組織工程化食道并用于動物體內(nèi)實驗提供很好的理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)，使體外構(gòu)建的支架最終用于臨床上病變食管的修復(fù)成為可能。

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Progress and prospect of electrospun silk fibroin in construction of tissue-engineering scaffold

Ling Chen, Yabin Zhu, Yuanyuan Li, Yuxin Liu, and Junyao Yu

Medical School of Ningbo University, Ningbo 315211, China

Silk fibroin is a natural macromolecular fibroin. It has broad prospects in tissue engineering application due to its good physical and mechanical properties and good biocompatibility. This paper reviews its chemistry structure, property, the usage as matrix of tissue-engineering scaffold using electrospinning technology, and the influence on growth, proliferation and function of vascular endothelial cell, smooth muscle cell, keratinocyte and fibroblast. It also addresses the advantages and disadvantages of silk fibroin applied in tissue engineering study like artificial vascular, skin, bone stent etc. The potential applications on esophageal tissue engineering and regenerative medicine were discussed.

silk fibroin, electrospinning technology, tissue engineering, scaffold construction

隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，組織工程這一學(xué)科也越來越受到人們的關(guān)注。組織工程研究中最重要的環(huán)節(jié)是三維支架的構(gòu)建及支架與細(xì)胞的復(fù)合，高分子材料如聚乳酸 (PLA)、聚己內(nèi)酯 (PCL)、聚乙烯醇(PVA) 等因具有良好的力學(xué)機械性能及生物可降解性而受到廣泛關(guān)注，其來源廣泛、成本低廉、易造型等特點都是天然高分子所無法比擬的。而天然生物材料，如膠原、殼聚糖、明膠、去細(xì)胞外基質(zhì)等，因其普遍存在于生物體內(nèi)，生物和細(xì)胞相容性好等特點，也一直受到研究者的關(guān)注。但由于它們來源有限、價格相對昂貴，限制了它們在構(gòu)建支架上的應(yīng)用。絲素蛋白因為其優(yōu)良的機械性能和易制得等優(yōu)點，在組織工程上的應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。絲素蛋白隨著不同的存在形式其力學(xué)性能會有所不同，以纖維形式存在的絲素蛋白的力學(xué)性能更佳[1]，而電紡絲技術(shù)是制備納米纖維的最佳方法[2-4]。本文就絲素蛋白的結(jié)構(gòu)特點及其在電紡絲法制備組織工程用支架方面的應(yīng)用作了概述。

September 7, 2010; Accepted: January 5, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30870645), Qianjiang Talents Project of Zhejiang Province (No. 2007R10004).

Yabin Zhu. Tel: +86-574-87609592; E-mail: zhuyabin@nbu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 30870645)，浙江省錢江人才項目 (No. 2007R10004) 資助。