白藍(lán)4種不同外植體組織培養(yǎng)再生能力的效應(yīng)

陳華斌，詹國勇，鄭耀光，盧永奮，馬春梅

（汕頭市白沙蔬菜原種研究所，廣東汕頭，515800）

作物種間雜交在品種的創(chuàng)新、改良方面有良好的優(yōu)勢，但種間雜交的成功率極低，雜交后種胚多數(shù)在2～3周內(nèi)死亡，能存活的種胚也因發(fā)育不全而致結(jié)籽率極低或不結(jié)籽，常規(guī)雜交育種很難獲得種間一代種子。白藍(lán)（Brassica pekinenis×B.olercea，n=19）是蕓薹屬蔬菜大白菜和結(jié)球甘藍(lán)種間雜交育成的結(jié)球性蔬菜，其F1代和后代不易結(jié)籽[1]。利用白藍(lán)不同外植體組織培養(yǎng)，建立植株再生體系是獲得種質(zhì)資源的理想途徑之一。但由于外植體及其他因素的影響，植株再生速度、脫分化頻率和再生能力存在一定的生物效應(yīng)差異。為此，比較了白藍(lán)4種不同外植體材料離體微繁效果，以期為白藍(lán)建立高效的植株再生體系提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以白藍(lán)未開花植株的莖尖、莖段、葉柄和葉片為外植體材料。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10瓶，每瓶外植體數(shù)5個(gè)。

1.2 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件

愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基為MS，添加2個(gè)激素配比濃度6-BA （6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）和1個(gè)激素配比濃度IBA（吲哚丁酸），具體見表1。小苗促根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.1 mg/L IBA。各培養(yǎng)基均加入蔗糖3%，瓊脂0.8%，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度（22±1）℃，光照 12 h/d，光照強(qiáng)度 3 000 lx。

1.3 外植體的處理

外植體經(jīng)自來水表面清洗后放入75%酒精中消毒30 s，無菌水沖洗后用0.1%升汞滅菌，莖段滅菌10 min，莖尖、葉柄、葉片滅菌8 min，滅菌后無菌水滌洗5～6次，吸干水分，植入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)上。外植體大小：莖尖長約0.5 cm，莖段、葉柄1 cm，葉片為1 cm2。愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)每10 d更換1次培養(yǎng)基。

1.4 不定芽生根培養(yǎng)

當(dāng)不定芽2～3片小葉時(shí)，從莖基部切下接種于生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。約14 d可完成生根。生根小苗植于泥炭和珍珠巖混合的基質(zhì)中，14 d后移至大田定植，成活率達(dá)95%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的差異

莖尖在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中萌動(dòng)最早，僅7 d就有乳白色的愈傷組織形成，4周后愈傷組織增大為團(tuán)塊狀，質(zhì)地中等、淡綠色，誘導(dǎo)率為52.4%。莖段形成愈傷組織相對較晚，10 d左右切口處才形成少量淡白色愈傷組織，團(tuán)塊小、質(zhì)地較硬，誘導(dǎo)率最高，達(dá)76.9%。葉柄經(jīng)更換2次培養(yǎng)基后才萌動(dòng)分化，愈傷組織團(tuán)塊狀、質(zhì)地疏松、水浸狀明顯，部分組織類玻璃化，易褐化，誘導(dǎo)率為21.5%。葉片培養(yǎng)約12 d，葉片面積增大、卷曲，只在切口邊緣形成愈傷組織，團(tuán)塊小、色澤暗黃，此類組織極易褐化死亡，存活的組織需經(jīng)多代培養(yǎng)才能獲得理想的團(tuán)塊愈傷組織，誘導(dǎo)率僅19.3%。

表1 4種外植體誘導(dǎo)分化的影響效應(yīng)

2.2 不定芽分化情況

莖尖形成的愈傷組織經(jīng)35 d的芽分化培養(yǎng)，可獲得叢生不定芽，平均分化芽增殖倍數(shù)為3.9。不定芽形態(tài)正常，葉色綠，生長勢強(qiáng)，畸形苗率低。莖段不定芽的分化形成有2種方式：①愈傷組織分化出不定芽，②莖段腋芽直接萌生出不定芽。經(jīng)腋芽直接萌生的不定芽形成時(shí)間更早，最早分化不定芽僅12 d；莖段誘導(dǎo)的不定芽質(zhì)量好，苗壯、色濃綠、易生根，芽分化率達(dá)4.6倍。葉柄形成的愈傷組織，經(jīng)45 d以上的繼代培養(yǎng)，能獲得叢生不定芽，芽分化率3.5倍。不定芽質(zhì)量一般，有部分不定芽葉片粘連或玻璃化。葉片所誘導(dǎo)的愈傷組織經(jīng)60 d繼代培養(yǎng)才能獲得叢生不定芽，平均分化率3.1倍。不定芽長勢一般，畸形率較高，部分不定芽不具備生長點(diǎn)，僅分化出葉片（表1）。

2.3 生根和馴化

4種不同外植體所誘導(dǎo)的不定芽生根率為95%～98%，無明顯差異。在0.1 mg/L IBA的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)中生根效果好，平均生根4.6條以上。健壯的不定芽生根培養(yǎng)14 d將獲得理想的根系。而玻璃化樣或水浸狀的不定芽生根相對較晚，一般需培養(yǎng)20 d左右才完成生根過程，各生根小苗馴化成活率均在95%以上（表1）。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，白藍(lán)4種不同外植體材料均能誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。植物外源激素是白藍(lán)再生體系中誘導(dǎo)分化的關(guān)鍵因素之一，如細(xì)胞分裂素對外植體愈傷組織、不定芽作用明顯，IBA有利于根系的分化。但外源激素濃度的高低對愈傷組織、不定芽、根系的誘導(dǎo)效果不同，高濃度6-BA有利于愈傷組織的形成，而較低濃度的6-BA有利于芽增殖培養(yǎng)，生根階段則不需添加6-BA。因此在各培養(yǎng)階段對外源激素的調(diào)控是必需的。此外，外植體的生理狀態(tài)對誘導(dǎo)分化率也有一定的影響，趙建萍[2]發(fā)現(xiàn)在艾西絲南瓜子葉的離體培養(yǎng)中，4～5 d苗齡子葉是誘導(dǎo)芽分化的最佳時(shí)期，而侯喜林等[3]則發(fā)現(xiàn)在矮腳黃不結(jié)球白菜子葉離體再生植株中，11～15 d苗齡的子葉分化效果最佳。本試驗(yàn)中葉片誘導(dǎo)分化率低于莖尖、莖段，可能與葉片苗齡偏大有關(guān)。

[1]盧永奮，柳江海，謝順贊，等.白藍(lán)無性繁殖試驗(yàn)初探[J].長江蔬菜，2004（7）：43-44.

[2]趙建萍.‘艾西絲’南瓜子葉的離體培養(yǎng) [J].園藝學(xué)報(bào)，1999，26（3）：196-197.

[3]侯喜林，曹壽椿.不結(jié)球白菜子葉離體培養(yǎng)再生植株[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，17（3）：60-64.