乳酸菌在飼料青貯中的應用及研究進展

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(1.內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院，內蒙包頭 014109；2.內蒙古農業(yè)大學)

乳酸菌是促使青飼料發(fā)酵的主要微生物，是指一類以糖為原料的消耗葡萄糖50%以上、厭氧型、產生乳酸、革蘭氏陽性，不形成芽孢的細菌。乳酸菌依其發(fā)酵糖生產乳酸的能力分為兩類，一類是同型發(fā)酵乳酸菌(Homo-fermentative lactic acid bacteria);另一類是異型發(fā)酵乳酸菌(Hetero-fermentative lactic acid bacteria)[1]。同型發(fā)酵乳酸菌在生產乳酸和青貯飼料方面更有效,耗能更少，且容易保存營養(yǎng)物質，屬比較經(jīng)濟的發(fā)酵類型。

青貯能否成功則很大程度上取決于同型發(fā)酵乳酸菌能否迅速大量繁殖，篩選并培養(yǎng)最適合的乳酸菌是關鍵，調節(jié)青貯料內微生物區(qū)系，調控青貯發(fā)酵過程，創(chuàng)造適宜的厭氧環(huán)境，促進多糖物與粗纖維的轉化，從而有效地提高青貯飼料的質量，這是近30年來青貯研究的熱點。

本文主要對乳酸菌在飼料青貯中的應用及研究進展進行簡要綜述，供參考。

1 乳酸菌(LAB)在飼料青貯中的應用

1.1青貯歷史 青貯飼料在世界各地有著悠久的發(fā)展歷史。據(jù)考證，青貯飼料起源于古埃及文化鼎盛時期(McDonald，1981.)[2]；在我國，600多年前的元代(王禎農書)和清代(風廣義)中曾記載有苜蓿、馬齒莧等青飼料的發(fā)酵方法。但實際應用于生產是在18世紀初期，1885年德國人庫英(G.Kuin)及G.Frg報道了青貯飼料技術方面的文章；我國最早關于青貯飼料的試驗研究報道是1944年發(fā)表于《西北農林》的“玉米窖貯藏青貯料調制試驗”。1943年西北農學院教授王棟、助教盧得仁首次進行帶棒玉米窖貯藏青飼料，并向陜西及全國推廣。

1.2微生物青貯劑的種類和研究概況 微生物青貯劑(SIB)，又稱青貯接種菌，生物青貯劑，青貯飼料發(fā)酵劑，是專門用于飼料青貯的一類微生物添加劑，由一種或多種乳酸菌、酶和一些營養(yǎng)物組成，采用人工加入菌種的方法，有利于這類乳酸菌盡快達到足夠的數(shù)量，加快乳酸菌發(fā)酵產酸，決定著青貯質量的好壞。

1.2.1乳酸菌制劑 理想的青貯應是乳酸菌控制整個發(fā)酵過程，乳酸生成占絕對優(yōu)勢。乳酸菌制劑的添加或直接接種乳酸菌可以加快乳酸菌發(fā)酵進程，改善青貯發(fā)酵品質，如Seale等(1986)[3]研究報道其添加效果明顯。Weinderg.等(1996)[4]研究指出，采食添加乳酸菌制劑青貯料的家畜，產奶量和日增重顯著提高。Fllya等(2007)[5]研究表明，乳酸菌接種劑對苜蓿青貯具有極好的效果，可以降低pH值，改善發(fā)酵品質。上述結果表明，接種乳酸菌或添加乳酸菌制劑可明顯改善飼料的發(fā)酵品質，提高動物生產性能。目前主要使用的菌種有Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium和Pediococcus pentosaceus等。

據(jù)Naoki Nishino(1999)[6]等報道，近年來，Ohshima等進行的綠色發(fā)酵汁(PFJ)調制青貯研究。PFJ類似于乳酸菌制劑，通過發(fā)酵培養(yǎng)植株上的固有乳酸菌以達到乳酸菌迅速增殖的目的。添加PFJ可明顯降低生產成本，工藝流程簡單，且添加入青貯料后可迅速提高青貯料中的乳酸含量，降低pH值，抑制梭菌活動，保護蛋白質的分解損失，在改善青貯發(fā)酵品質方面較乳酸菌更穩(wěn)定。據(jù)韓瑞麗(2002)[7]報道，PFJ可以使附著在牧草表面的乳酸菌群增殖，作為乳酸發(fā)酵的啟動因子，顯示其有效性，是乳酸菌制劑的一種良好替代品。

1.2.2碳水化合物類 碳水化合物類添加劑能直接彌補乳酸菌發(fā)酵底物較低的缺陷，如糖蜜，是制糖工業(yè)的副產物，添加入青貯料后，可使pH及NH3-N含量降低，乳酸及可溶性糖的含量增加，同樣添加適量葡萄糖可明顯提高苜蓿青貯品質。

1.2.3細胞壁降解酶 主要作用于兩方面，一是降解細胞壁成分，增加青貯發(fā)酵底物，促進乳酸發(fā)酵優(yōu)勢的形成;二是酶降解作用后易被瘤胃微生物作用，提高有機物消化率。據(jù)YuZhu, Naoki Nishino等(1999)[8]報道，添加細胞壁降解酶的苜蓿青貯與對照組相比，乳酸含量明顯提高(P<0.01)，pH值下降(P< 0.01)，且對經(jīng)處理后的青貯料進行瘤胃降解試驗，發(fā)現(xiàn)可快速降解DM，從而使青貯料品質得到明顯改善。

1.2.4纖維素酶 據(jù)席興軍等(2003)[9]報道，在玉米秸青貯飼料中加入乳酸菌和纖維素酶，可使青貯料中的氨態(tài)氮與總氮比、NDF、ADF含量顯著降低，青貯品質得到明顯的改善。

2 乳酸菌的研究進展

乳酸菌是微生物青貯劑中最早應用的菌種，研究報道最多。近年來，許多學者對乳酸菌性質，特別是分子生物學方面進行了研究，取得了較多的新進展。

黃良昌等(2002)[10]曾對保加利亞乳酸菌的濃縮培養(yǎng)進行了研究。優(yōu)化培養(yǎng)條件:發(fā)酵時間為12 h，起始pH值5.80，發(fā)酵溫度40℃；確定MRS為培養(yǎng)基:MRS+7.5%番茄汁+12%麥芽汁+0.009 mol/L CaCl2+2%乳清。通過中和試驗，可使菌體濃度達到9.55×109個/mL。

李霞等(2005)[11]應用改良MRS培養(yǎng)基，對保加利亞乳酸菌進行了超濃縮培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，采用了離心式半連續(xù)培養(yǎng)技術，最終使菌體濃度達到了1.045×1010個/mL。

近年來，黃紅等(2004)[12]對乳酸菌素進行了詳細研究。日前國內外報道的乳酸菌素約有40余種，乳酸菌素是在乳酸菌代謝過程中，合成并分泌到環(huán)境中的一類對革蘭氏陽性菌(尤其是親緣性較近的細菌)具有抑制作用的殺菌蛋白或多肽。分別由乳球菌、片球菌、明串球菌、乳桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、鏈球菌、肉食桿菌等屬的菌株產生。乳酸菌可通過其代謝產物，主要是酸性物質和乳酸菌素等，起到有效的抑菌作用。

乳酸菌素的功能類似抗菌素，但作用機制不同，具專一性，完全不產生抗藥性及毒性，可有效抑制病原菌的生長。乳酸菌素的代謝產物(Nisin乳鏈菌肽)，能有效抑制多種導致腐敗的革蘭氏陽性菌，尤其對產生芽孢的細菌特別有效，是一種高效、無毒的天然抑菌劑。抑菌實驗表明，乳酸菌素不僅對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而且對革蘭氏陰性菌也有不同程度的抑制作用，故可治療胃、腸炎。乳酸菌素還能促進胃液分泌，增強胃腸蠕動，促進食物消化。目前的藥用制劑有麗珠腸樂、普樂拜爾等。

據(jù)Alexander等(2001)[13]報道，自2001年完成第一株乳酸菌即乳酸乳球菌IL 1403的全基因組測序以來，目前已公布完成測序的乳酸菌包括:乳酸乳球菌IL1403、長雙歧桿菌NCC2705、植物乳桿菌WCSF1、約氏乳桿菌NCC533及嗜酸乳桿菌NCFM/ATCC700396等。乳酸菌基因組的大小在一個特定的范圍內，從1.8～2.6 Mb不等，只有植物乳桿菌相對較大，為3.3 Mb。乳酸桿菌和雙歧桿菌分別具有較低和較高的GC含量，乳酸桿菌的GC含量為30.9%～50%不等，而長雙歧桿菌則高達60.1%。另外，還有一些乳酸菌具有非常復雜的插入重復序列(IS)，說明該菌具有較高的遺傳可塑性。

據(jù)王保平等(2010)[14]報道，乳酸菌遺傳學研究開始于20世紀70年代初，由于乳酸菌在青貯飼料中有著十分重要的作用，從而激發(fā)了人們對染色體外遺傳物質，即質粒的研究。質粒(plasmid)是一段存在于染色體外或整合在染色體上的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，含50～100個基因。質粒可獨立存在于細菌染色體外，能夠進行自我復制、穩(wěn)定遺傳和表達;也可整合和消失，并可在一定范圍內進行細胞間傳遞。許多次生代謝產物(如抗生素、色素)的合成一般受質?？刂?。質粒并非細菌生命活動所必需，但可攜帶決定細菌某些遺傳特性的基因，是遺傳工程的重要載體。

目前，已有多種方法可從細菌中提取質粒DNA，如堿裂解法、煮沸法、微波爐法，此外還有有機溶劑法等。2008年，劉紅娟等結合Anderson與Sullivan等的乳酸菌質粒提取方法和質粒提取原理設計了乳酸菌質粒提取方法，并對其中的各個步驟進行了優(yōu)化，確定溶菌酶用量為2.5 mg/mL，作用時間為15 min，加入異丙醇后室溫放置5 min,從而得到了一種乳酸菌質粒DNA高效、快速的提取方法。

乳酸菌質粒的研究是乳酸菌遺傳學研究的基礎，乳酸菌質粒的研究對于篩選新的優(yōu)良菌種，改良現(xiàn)有的生產菌種具有良好的作用。如果把異型發(fā)酵菌種中可以調高有氧穩(wěn)定性的基因，通過基因重組，建立良好的基因工程，再加入同型發(fā)酵菌中進行改良，則可為飼料工業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。

3 小結與展望

乳酸菌是人和大多數(shù)動物腸道內的常見細菌，因其在各個領域中的長期應用已證明不具有致病性，被公認為安全級(GRAS)微生物。20世紀90年代，國內外學者開始致力于對乳酸菌分子生物學及作用機制的研究，以乳酸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌作為基因工程受體菌，應用基因工程技術有目的、有選擇地研制新一代微生態(tài)制劑，通過分子生物學技術的不斷進步為人們探索其新的應用潛力提供了基礎。

Le LOIR和RAW N等相繼開發(fā)出多種適合于乳酸球菌的信號肽系列(Langella，2001)[15]，為探索其他外源蛋白在乳酸菌中的大量表達奠定了基礎。乳酸桿菌是一種良好的疫苗載體，用乳酸桿菌作為疫苗載體不僅可使口服的乳酸桿菌刺激產生粘膜及全身免疫反應，提高某些免疫活性因子，如IL-2,IFN-α的分泌，而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道，同時也可穿過腸壁進入粘膜下層，進而引起細胞免疫和體液免疫。更有意義的是，法國和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達輪狀病毒的抗原基因，然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產酸奶，來預防輪狀病毒性腹瀉?？傊?，隨著基因工程技術的發(fā)展及研究水平的不斷提高，通過對乳酸菌進一步改造、表達調控的認識不斷深入和對免疫學特別是粘膜免疫機制的研究，可以肯定將會得到更為優(yōu)良的益生乳酸菌基因工程菌。

隨著人們對乳酸菌功能了解的深入，乳酸菌的生物青貯劑的需求量也將進一步增大。因此，對應用于飼料青貯中的乳酸菌種進行進一步研究和開發(fā)有著重要意義。

總之，未來乳酸菌的應用范圍將更加廣泛，功能將更加完備，乳酸菌的研發(fā)和應用將具有更廣闊的發(fā)展前景。

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