湖北茯苓菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程△

李苓，王克勤，邊銀丙，蘇瑋，王蘭英

（1.北京同仁堂湖北中藥材有限公司，湖北 武漢 430071；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430074；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430074）

湖北茯苓菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程△

李苓1，王克勤2*，邊銀丙3，蘇瑋2，王蘭英1

（1.北京同仁堂湖北中藥材有限公司，湖北 武漢 430071；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430074；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430074）

按照我國 《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）》的綜合技術(shù)要求，通過對湖北茯苓菌種培育場地環(huán)境，菌種制備，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢驗規(guī)程等規(guī)范化研究，制訂了湖北茯苓菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程，以指導(dǎo)湖北茯苓產(chǎn)區(qū)茯苓菌種的規(guī)范化生產(chǎn)。

茯苓；菌種；規(guī)范化

茯苓是我國傳統(tǒng)常用中藥材及藥食兼用資源，其物種為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf[1]。野生茯苓在我國分布較廣，但零星分散，難以采挖，茯苓藥材多由人工栽培提供。我國是世界上唯一進(jìn)行茯苓栽培的國家[2]，有著悠久的栽培歷史，長期由產(chǎn)區(qū)農(nóng)民使用松樹段木或樹蔸作培養(yǎng)料，選用新鮮菌核作種源，20世紀(jì)70年代以來，改進(jìn)為人工分離、培育的 “純菌絲菌種”作種源，進(jìn)行擴(kuò)大培育[3]。 “九五”期間，我們針對茯苓栽培中普遍存在的菌種來源混雜，生產(chǎn)操作隨意，質(zhì)量不穩(wěn)等弊端，進(jìn)行了 “茯苓藥材規(guī)范化種植研究”[4]，期間按照我國 《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）》的綜合技術(shù)要求，制訂了 “茯苓菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程”，現(xiàn)報道如下。

1 內(nèi)容與適用范圍

本規(guī)程規(guī)定了茯苓菌種規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)的術(shù)語和定義，母種分離、培養(yǎng)，原種擴(kuò)制，栽培種生產(chǎn)，菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，菌種質(zhì)量檢驗規(guī)程，菌種的包裝、標(biāo)識、儲存及運(yùn)輸。

本規(guī)程適用于湖北及我國茯苓產(chǎn)區(qū)茯苓菌種的規(guī)范化生產(chǎn)。

2 引用標(biāo)準(zhǔn)

GB3095-1996大氣環(huán)境質(zhì)量二級標(biāo)準(zhǔn)

GB5749-2006生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

NY/T528-2002食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（試行）》國家藥品監(jiān)督管理局局令第32號

《湖北省食用菌菌種管理辦法》湖北省人民政府令第330號

3 定義

3.1 菌種（pure culture）

經(jīng)人工培養(yǎng)并可供進(jìn)一步繁殖或栽培使用的茯苓菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料，包括母種、原種、栽培種。

3.2 種苓（mother sclerotium）

經(jīng)精心培育、選擇，用于分離茯苓母種的優(yōu)質(zhì)鮮茯苓菌核。

3.3 菌齡（cell ages）

菌種菌絲體的生長時間，即菌種自接種至使用之間的間隔時間。

4 母種分離、培養(yǎng)

4.1 母種培育廠的環(huán)境及設(shè)施要求

一般設(shè)置在大專院?；蚩蒲袉挝?，應(yīng)具有接種室、儀器室、配料室、實驗室。必須配備恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱、冰箱、顯微鏡、天平及接種設(shè)備，試管、培養(yǎng)皿、三角瓶等玻璃儀器，消毒藥品，化學(xué)試劑等。

從事母種分離、培育的人員必須具備藥學(xué)、生物或相關(guān)學(xué)科大學(xué)學(xué)歷、副高級藥學(xué)技術(shù)職稱及執(zhí)業(yè)藥師資格，并具有獨立工作能力和豐富的操作經(jīng)驗。

4.2 種苓的選擇

在傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，經(jīng)提前精心培育而成的優(yōu)質(zhì)鮮茯苓菌核；個體較大，近球形，外皮較薄，色黃棕或淡棕，有明顯的白色或淡棕色裂紋，重量＞2.5 kg；生長旺盛，切開或掰開后，內(nèi)部苓肉色白，茯苓氣味濃郁，有乳白色汁液或淡青色漿汁滲出；外皮完整，無蟲咬損傷，無腐爛異味。

種苓選定后要及時進(jìn)行分離使用，若需暫短儲存或運(yùn)往他地使用，必須埋于濕沙中儲存，以防干燥。

4.3 母種培養(yǎng)基的制備

4.3.1 配方 馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

4.3.2 配制 將馬鈴薯去皮，洗凈，切片，加水1 000 mL，煮沸30 min，過濾，濾液中加入瓊脂，煮至全部溶化，再加入葡萄糖，攪拌溶化，補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝于試管中，塞上棉塞。

4.3.3 滅菌 將配制的母種培養(yǎng)基置高壓滅菌鍋內(nèi)，用1.05 kg·cm－2壓力（溫121℃）滅菌30 min，趁熱擺放斜面，冷卻后備用。

4.4 組織分離

4.4.1 分離前準(zhǔn)備 按無菌操作法對無菌室或無菌箱內(nèi)的空氣、環(huán)境、操作臺面、用具及移入的培養(yǎng)基試管等進(jìn)行表面消毒滅菌，操作人員按無菌操作著裝、手部消毒。

4.4.2 種苓表面消毒 將選好的種苓用清水沖至無泥沙，待表面稍干后，移入無菌室凈化工作臺上。用0.2%升汞或70%乙醇沖洗，進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗數(shù)遍，除去表面藥液。打開紫外線燈照射5～10 min。

4.4.3 種苓切剖 待種苓表面稍干，用滅菌刀從種苓的中央切一淺口，掰開。

4.5 接種

用滅菌的解剖刀或接菌鏟在近茯苓皮內(nèi)側(cè)2～3 cm處，挑取0.1 cm厚、0.5 cm見方的白色苓肉，接于試管斜面培養(yǎng)基上。

用同樣方法依次挑取苓肉進(jìn)行分離、接種一批試管。將分離、接種后的試管，貼上標(biāo)簽，其內(nèi)容應(yīng)符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規(guī)定，如編號、種苓來源、接種時間等。

4.6 培養(yǎng)與剔雜

將試管置于22～25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。培養(yǎng)2 d，可見接種塊周圍長出白色絨毛狀的茯苓菌絲。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見茯苓菌絲在培養(yǎng)基上不斷延伸，5～7 d，茯苓菌絲即可長滿培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)過程中經(jīng)常觀察菌絲生長情況，凡菌絲長速慢、稀疏、不勻、發(fā)黑、污染者，須及時剔出。母種轉(zhuǎn)管次數(shù)應(yīng)控制在2～3次。

5 原種擴(kuò)制

5.1 原種廠的環(huán)境及設(shè)施要求

可選建在產(chǎn)區(qū)，但必須遠(yuǎn)離交通干道，通水、通電、通路，無粉塵污染，大氣、水質(zhì)等環(huán)境質(zhì)量，必須符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，廠房周圍應(yīng)有綠化樹木或草皮，生產(chǎn)區(qū)周圍無豬圈、牛欄、廁所等污染源。廠內(nèi)環(huán)境必須整潔、干凈，并定期打掃、清理，保持墻壁及地面清潔衛(wèi)生，做到無塵垢、無污穢。

原種廠須經(jīng)縣級農(nóng)業(yè)部門審查批準(zhǔn)，領(lǐng)取菌種生產(chǎn)許可證。廠內(nèi)分設(shè)洗滌室、配料室、滅菌室（區(qū)）、接種室（具緩沖間）、培養(yǎng)室、貯存室等，必須配備接種箱、高壓滅菌鍋或常壓滅菌灶（自制）、恒溫箱、培養(yǎng)室木架、天平、磅秤及接種設(shè)備，玻璃儀器，消毒藥品，化學(xué)試劑等。

從事原種擴(kuò)制、培育的人員必須具備高中以上（含高中）學(xué)歷、農(nóng)業(yè)技術(shù)員職稱，掌握微生物基礎(chǔ)知識，具有獨立工作能力及熟練的操作技能。講究個人衛(wèi)生，操作中必須使用專用的工作服、帽。嚴(yán)格操作，認(rèn)真填寫原始記錄。

5.2 原種培養(yǎng)基的制備

5.2.1 配方 小麥粒90%、松木屑10%、營養(yǎng)液[1%蔗糖、0.5%NH4NO3或（NH4）2SO4]。

5.2.2 配制 除去麥粒癟粒、雜質(zhì)，洗凈，置40℃左右的營養(yǎng)液中浸泡10 h，取出，瀝干，與5%的松木屑混勻，裝于500 mL廣口瓶或折角呈方形底的聚丙烯塑料袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4絲）中，邊裝邊振搖，并用扁形鐵鉤或細(xì)木棒稍壓實，使之均勻裝至瓶（或袋）肩處。將另5%松木屑用營養(yǎng)液潤濕，覆蓋于培養(yǎng)基表面，厚約0.5 cm?？珒羝浚ɑ虼﹥?nèi)、外壁沾附物，塞緊棉塞，扎口。

5.2.3 滅菌 將配制的原種培養(yǎng)基置高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，用0.137 3 MPa壓力（溫度126℃）滅菌2 h，或用流通蒸氣（100℃）滅菌8～10 h，冷卻后備用。

5.3 接種

在無菌室內(nèi)，用無菌操作法，挑取長寬各1.5 cm左右的優(yōu)質(zhì)母種塊（連同培養(yǎng)基），移植接種于母種培養(yǎng)基上端中央，隨即蓋塞或扎口。

在接種后的原種瓶（袋）上貼上標(biāo)簽，其內(nèi)容應(yīng)符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規(guī)定，如編號、母苓來源、接種時間等。

5.4 培養(yǎng)與剔雜

將接種后的原種瓶（袋）置于25～30℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)。當(dāng)茯苓菌絲生長至瓶（袋）內(nèi)2/3處時，移入10～25℃的常溫培養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。接種后的母種塊，在原種培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)1～2 d，可見茯苓菌絲恢復(fù)生長，并逐漸由母種塊向外延伸。培養(yǎng)過程中須經(jīng)常檢查菌絲生長情況，凡表現(xiàn)異常，特別是長速慢、菌絲稀疏、不勻、發(fā)黑、污染者須及時剔出，深埋。

5.5 清場

每一批次的原種生產(chǎn)完成后，均應(yīng)進(jìn)行清場，包括清除生產(chǎn)中的廢棄物，作好環(huán)境清潔，將物品定位放置，并做好清場記錄。

6 栽培種生產(chǎn)

6.1 栽培菌種廠的環(huán)境及設(shè)施要求

茯苓栽培菌種廠可選建在產(chǎn)區(qū)，廠周及廠內(nèi)環(huán)境要求等與原種廠相同。

栽培菌種廠須在鄉(xiāng)鎮(zhèn)（或縣）備案。廠內(nèi)分設(shè)洗滌室、配料室、滅菌室（區(qū)）、接種室（或接種箱）、冷卻室、培養(yǎng)室、成品貯存室、原料貯藏室、工作室等。菌種廠要求安裝防蟲、防鼠設(shè)備，并配備常壓滅菌灶（自制）、培養(yǎng)室木架、天平、磅秤及接種設(shè)備，必要玻璃儀器，消毒藥品，化學(xué)試劑等。

從事栽培菌種生產(chǎn)、培育的人員必須具備初中以上（含初中）學(xué)歷，經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)合格，熟悉微生物基礎(chǔ)知識，具有獨立工作能力及操作技能。講究個人衛(wèi)生，操作中必須使用專用的工作服、帽。嚴(yán)格操作，認(rèn)真填寫原始記錄。

6.2 栽培種培養(yǎng)基的制備

6.2.1 配方 松木屑78%、米糠（或麥麩）20%、蔗糖1%、熟石膏1%、水料比1∶1.0～1.2。松木屑要求新鮮、干燥，無霉變，使用前應(yīng)經(jīng)日曬或室內(nèi)堆放干燥處理。

6.2.2 配制 首先將蔗糖溶于水，將米糠（或麥麩）與熟石膏混勻，再加入松木屑，拌勻，然后加入蔗糖水翻拌均勻，使培養(yǎng)基含水量65%～70%（即緊握培養(yǎng)基料使指尖稍見滲水為度）。放置30 min，待水分均勻滲入料中進(jìn)行裝袋；將折角呈方形底的聚丙烯塑料菌種袋（Φ12 cm，高25 cm，厚4絲）撐開，裝料，每袋400 g左右，壓實，擦凈袋口內(nèi)外壁沾附物，扎口。

6.2.3 滅菌 將上述料袋置高壓滅菌鍋內(nèi)，用0.137 3 MPa壓力（溫度126℃）滅菌2 h，或置常壓滅菌灶內(nèi)，用流通蒸氣（100℃）滅菌8～10 h，冷卻后備用。

6.3 接種

在無菌室內(nèi)，用無菌操作法，將原種瓶（袋）打開，除去原種表面的菌膜及表面培養(yǎng)物。用接種槍或接種匙取5 g左右略加搗碎的原種塊，移于栽培種培養(yǎng)基上，封口。

在接種后的菌袋上貼上（印有）標(biāo)簽，其內(nèi)容符合 《湖北省食用菌菌種管理辦法》規(guī)定，如編號、原苓來源、接種時間等。

6.4 培養(yǎng)與剔雜

高溫培養(yǎng)：將接種后的菌種袋連同周轉(zhuǎn)箱一起置于高溫培養(yǎng)室內(nèi)，在25～30℃溫度下培養(yǎng)。

常溫培養(yǎng)：待菌絲生長延伸至培養(yǎng)料2～3 cm處，移入10～25℃的常溫培養(yǎng)室內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，20～30 d，茯苓菌絲可長滿菌袋。

培養(yǎng)過程中，經(jīng)常檢查培養(yǎng)室溫、濕度變化及菌絲生長情況，發(fā)現(xiàn)菌絲長速明顯緩慢，菌絲稀疏、不均、地圖斑、發(fā)黑、雜菌污染，及時剔出，深埋。菌絲滿料后，逐一檢查菌種質(zhì)量，合格品裝入專用包裝袋內(nèi)，按批號歸類就地儲存。

6.5 清場

每一批次栽培種生產(chǎn)完成后，均應(yīng)進(jìn)行清場，包括清除生產(chǎn)中的廢棄物，作好環(huán)境的清潔，將物品歸位，并做好清場記錄。

7 菌種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

7.1 母種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

菌齡＜30 d；菌絲色白、均勻、致密、粗壯，茯苓特異香氣濃郁；菌絲體表面可見晶瑩的露滴狀分泌物；菌種試管完整無損，棉塞嚴(yán)密，無雜菌污染。

7.2 原種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

菌齡20～45 d；菌絲生長旺盛，潔白、均勻、致密，爬壁現(xiàn)象明顯，有根狀菌索者佳；菌絲體尖端可見乳白色露滴狀分泌物，茯苓特異香氣濃郁；菌種瓶（或袋）完整無損，無雜菌污染。

7.3 栽培種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

菌齡30～60 d；菌絲潔白致密，生長均勻，布滿菌袋內(nèi)；菌絲體尖端可見晶瑩露滴狀分泌物，茯苓特異香氣濃郁；菌袋完整無破損，菌絲充滿菌種袋（滿料），手握菌種袋，感覺堅實，無松散，無軟化。菌絲無發(fā)黃、發(fā)黑，地圖斑，軟化，無子實體出現(xiàn)，無雜菌污染。

8 菌種質(zhì)量檢驗規(guī)程

8.1 母種質(zhì)量檢驗規(guī)程

按照茯苓母種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在自然光下采取目測方法，每隔2 d于培養(yǎng)過程中觀察各試管菌種萌發(fā)情況、生長速度、菌絲形態(tài)；凡表現(xiàn)異常，特別是長速慢、菌絲稀疏、不勻、發(fā)黑、污染者，應(yīng)及時淘汰剔出；菌絲滿管后，按上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐支檢查，合格者置冰箱4℃保存。

8.2 原種質(zhì)量檢驗規(guī)程

按照茯苓原種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在自然光下采取目測方法，于培養(yǎng)過程中經(jīng)常觀察各菌種瓶內(nèi)菌種萌發(fā)、生長情況；凡發(fā)現(xiàn)菌絲長速明顯緩慢，菌絲稀疏、不均、地圖斑、發(fā)黑、污染者，應(yīng)及時剔出；菌絲滿瓶后，按上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐瓶檢查，合格者方可轉(zhuǎn)于下一道工序，作為茯苓栽培種生產(chǎn)的種源。

8.3 栽培種質(zhì)量檢驗規(guī)程

按照茯苓栽培種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在自然光下采取目測法，于菌種培養(yǎng)過程中經(jīng)常觀察各菌種袋內(nèi)菌種生長情況；發(fā)現(xiàn)菌絲體發(fā)黃、發(fā)黑、不均、地圖斑、污染者，應(yīng)及時剔出；逐一檢查各菌種袋，應(yīng)符合上述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且菌絲長滿菌種袋（滿料），菌絲無倒伏現(xiàn)象；手握菌種袋，感覺堅實，無松散，無軟化；檢驗合格者按一定數(shù)量裝入專用包裝袋中，并做好菌種質(zhì)量檢驗記錄。

9 包裝、標(biāo)識、儲存及運(yùn)輸

9.1 母種的包裝、標(biāo)識、儲存及運(yùn)輸

母種的包裝為試管，試管外應(yīng)貼有標(biāo)注編號、接種時間、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的標(biāo)簽。母種檢驗合格后，應(yīng)置于4℃冰箱保存條件下進(jìn)行儲存，儲存保質(zhì)期的菌齡＜30 d。

運(yùn)輸母種的外包裝為清潔、干燥的紙箱或?qū)Ｓ描F箱，裝箱時應(yīng)使用清潔、干燥的碎紙條填充試管間的空隙，使其固定。包裝外應(yīng)貼有標(biāo)注茯苓母種、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的專用標(biāo)簽。

茯苓母種的運(yùn)輸工具應(yīng)清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運(yùn)輸過程中應(yīng)注意防震、防潮。

9.2 原種的包裝、標(biāo)識、儲存及運(yùn)輸

原種的包裝為廣口菌種瓶或聚丙烯塑料菌種袋，瓶或袋外應(yīng)貼有標(biāo)注編號、母苓來源、接種時間、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的標(biāo)簽。

原種檢驗合格后，應(yīng)及時使用，或置于10～25℃的常溫培養(yǎng)室內(nèi)儲存。儲存期間應(yīng)按時進(jìn)行抽樣檢查，及時剔出不合格品，并認(rèn)真作好菌種儲存及抽樣檢查記錄。原種儲存保質(zhì)期的菌齡＜45 d。

運(yùn)輸原種的外包裝為清潔、干燥的專用紙箱或編織袋，箱（或袋）內(nèi)應(yīng)排放整齊，不留空隙，使其固定。包裝外應(yīng)貼有標(biāo)注茯苓原種、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的專用標(biāo)簽。

茯苓原種的運(yùn)輸工具應(yīng)清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運(yùn)輸過程中應(yīng)注意防震、防潮。

9.3 栽培種的包裝、標(biāo)識、儲存及運(yùn)輸

栽培菌種的包裝為聚丙烯塑料菌種袋，袋外應(yīng)貼有標(biāo)注編號、原苓來源、接種時間、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的標(biāo)簽。

栽培菌種檢驗合格后，應(yīng)及時使用，或置于10～25℃的常溫培養(yǎng)室內(nèi)儲存。儲存時，應(yīng)將菌種按一定數(shù)量裝入專用包裝袋中，單層置于貨架或墊板上，碼放整齊，不得疊放，以免使菌種局部溫度過高，導(dǎo)致衰亡。儲存期間應(yīng)按時進(jìn)行抽樣檢查，及時剔出不合格品，并認(rèn)真作好菌種儲存及抽樣檢查記錄。栽培菌種儲存保質(zhì)期的菌齡＜60 d。

運(yùn)輸原種的外包裝為清潔、干燥的專用紙箱或編織袋，箱（或袋）內(nèi)應(yīng)排放整齊，不留空隙，使其固定。包裝外應(yīng)貼有標(biāo)注茯苓栽培菌種、生產(chǎn)批號、生產(chǎn)單位等內(nèi)容的專用標(biāo)簽。

茯苓栽培菌種的運(yùn)輸工具應(yīng)清潔、干燥，不能與有毒、有害、有異味的物品混裝，運(yùn)輸過程中應(yīng)注意防震、防潮。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：224-225.

[2]婁隆后，朱慧真，周璧華.食用菌生物學(xué)及栽培技術(shù)[M].北京：中國林業(yè)出版社，1984：9.

[3]中國藥材公司.中國常用中藥材[M].北京：科學(xué)出版社，1995：1076-1085.

[4]付杰，王克勤，方紅，等.茯苓藥源及生產(chǎn)栽培現(xiàn)狀[J].中藥研究與信息，2002，4（2）：24-25.

“十二五”國家科技支撐計劃項目——茯苓規(guī)范化種植基地優(yōu)化升級及系列產(chǎn)品綜合開發(fā)研究（2011BAI06B03）

*王克勤，E-mail：hbwhwkq＠163.com

2011-10-08）