馬鈴薯脫毒試管苗擴(kuò)繁常見的污染及防治措施

穆艷娥，王拴福，姬青云，柴生武，鄧?yán)麗?，張東紅，石維山

（山西省薯類脫毒研究中心，山西 太原 030006）

利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯脫毒試管苗快繁時(shí)，常常會出現(xiàn)不同程度的污染，在高溫高濕的情況下污染更為嚴(yán)重，導(dǎo)致組織培養(yǎng)工作的失敗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在組織培養(yǎng)過程中，控制污染是非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文主要從污染的主要病原及癥狀、常見的污染及產(chǎn)生原因方面進(jìn)行了闡述，并提出了相應(yīng)的防治措施。

1 主要病原及癥狀

污染產(chǎn)生的病原主要有細(xì)菌和真菌兩類。細(xì)菌污染的癥狀出現(xiàn)較快，一般在接種1～2天即可出現(xiàn)，表現(xiàn)癥狀為在培養(yǎng)基或材料表面常出現(xiàn)黃色、粉液狀半透明膜狀。真菌污染的癥狀出現(xiàn)比細(xì)菌慢，一般在接種5～10天才有所表現(xiàn)，表現(xiàn)癥狀為初期如針狀的霧斑，以后長出菌絲，繼而很快出現(xiàn)黑、白、黃、綠等色的孢子。

2 常見污染及產(chǎn)生的原因

2.1 細(xì)菌污染

主要是由于材料本身或培養(yǎng)基滅菌不徹底造成的。接種前如果培養(yǎng)瓶清洗的不干凈而滅菌又不徹底，耐高溫的雜菌不能被殺死，接種前培養(yǎng)基就會被細(xì)菌污染；接種時(shí)如果工作人員操作不規(guī)范，使用未消毒或消毒不徹底的器械或者是用手接觸器皿邊緣或材料，也可導(dǎo)致接種后外植體周圍出現(xiàn)細(xì)菌污染。

2.2 真菌污染

接種前培養(yǎng)基就出現(xiàn)了真菌污染，其原因多數(shù)是由于封口不嚴(yán)或培養(yǎng)基存放的環(huán)境中孢子濃度過大造成的；其次，如果母液儲備液被污染，也能引起培養(yǎng)基表面大量真菌污染。接種后初期，培養(yǎng)基表面出現(xiàn)了真菌污染且位置不定，其原因可能是由于超凈工作臺的濾布不潔凈或接種室孢子濃度過大造成的。如果接種后較長時(shí)間出現(xiàn)了真菌污染，主要原因是培養(yǎng)材料攜帶了內(nèi)生菌或封口不嚴(yán)造成的。接種后外植體周圍出現(xiàn)真菌污染，主要原因是由于苗源瓶中的苗源已被雜菌感染，但由于感染初期菌源太小，工作人員肉眼不易發(fā)現(xiàn)，接種到培養(yǎng)基瓶上從而引起感染；另外，如果苗源瓶表面消毒不徹底，也可將菌帶入接種瓶內(nèi)而引起感染。

3 防治措施

利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行馬鈴薯脫毒試管苗快繁是一項(xiàng)無菌操作技術(shù)，不僅要求工作人員在操作過程中遵守?zé)o菌操作規(guī)程，而且培養(yǎng)室、工作人員的衣物以及操作過程中所用的一切用具、培養(yǎng)基、材料等都要求無菌，稍有疏忽就會導(dǎo)致組織培養(yǎng)工作的失敗，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

3.1 接種前消滅污染菌源

3.1.1 消滅容器雜菌，保證容器清潔。洗凈的玻璃容器應(yīng)發(fā)亮，內(nèi)外壁水膜均勻，瓶壁不掛水珠。瓶蓋也要認(rèn)真涮洗，清洗干凈后晾干與瓶子一起存放備用。取拿容器時(shí)盡量不接觸內(nèi)壁。

3.1.2 消滅水質(zhì)雜菌。培養(yǎng)基母液最好用蒸餾水配置，也可用純凈、無色透明、無懸浮物的食用水制作，以減少菌源和避免雜菌滋生蔓延。配置好的母液要置于4℃冰箱中保存。

3.1.3 培養(yǎng)基滅菌。培養(yǎng)基裝入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌時(shí),升溫初期打開放汽閥將冷空氣充分放盡，待鍋內(nèi)溫度升至105℃時(shí)關(guān)閉放汽閥。空氣排不盡易造成高壓低溫現(xiàn)象，達(dá)不到滅菌的目的。升溫至120～121℃穩(wěn)定滅菌20～25 min，但不宜超過30 min，否則易引起培養(yǎng)基凝固不良。為了增強(qiáng)滅菌效果,可以在培養(yǎng)基中加適宜的抗生素。

3.1.4 選擇無污染培養(yǎng)基。把高溫高壓滅菌的培養(yǎng)基置于無菌室內(nèi)保存，在室溫下放置2～3天，檢查培養(yǎng)基，剔除滅菌不徹底的培養(yǎng)基，選用干凈無菌的培養(yǎng)基。

3.1.5 接種室消毒。接種前，首先對超凈工作臺進(jìn)行徹底消毒。用75%的酒精棉擦拭超凈工作臺，然后打開紫外燈，照射20 min后關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)，用無菌風(fēng)吹10 min后方可開始工作。定期用紫外線燈光對接種室照射消毒 20 min，以達(dá)到殺滅接種室內(nèi)菌源的目的。

3.1.6 工作人員消毒。工作人員使用的工作服、帽子、口罩等要保持干凈，并定期進(jìn)行消毒。經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量，若發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修。

3.2 接種時(shí)嚴(yán)格無菌操作

3.2.1 仔細(xì)觀察待轉(zhuǎn)基礎(chǔ)苗，確認(rèn)無污染才能取用。用酒精棉(或酒精布)擦拭待轉(zhuǎn)瓶苗的外壁，消除附著在瓶外壁上的雜菌后轉(zhuǎn)入無菌室。

3.2.2 工作人員消毒。工作人員進(jìn)入無菌室時(shí)要洗手、換衣，并戴帽子和口罩，進(jìn)入后首先要用75%的酒精仔細(xì)擦手，然后將工作臺面及臺壁用75%的酒精棉(或酒精布)擦拭消毒。

3.2.3 接種工具消毒。所用的接種工具如鑷子、剪刀、支架都要從外到內(nèi)、從正到反在酒精燈的外焰上來回消毒冷卻后待用。接種時(shí)瓶口靠近酒精燈火焰，每接一瓶所用工具消毒一次。

3.2.4 接種后的培養(yǎng)基瓶口必須封嚴(yán),以減少瓶內(nèi)與室內(nèi)空氣的對流，控制氣流傳菌。

3.2.5 超凈工作臺上盡量少放瓶子，接種瓶、苗源瓶

(基礎(chǔ)苗)不能堆放過滿，以保證氣流暢通。

3.3 內(nèi)生細(xì)菌的防治

內(nèi)生細(xì)菌在外植體的初級培養(yǎng)中不易被發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，菌量慢慢累積發(fā)展才在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來。一般可通過在培養(yǎng)基中添加抗生素或抑菌劑來防止和減少細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染。在使用抗生素時(shí)需要注意以下幾點(diǎn):（1）對癥下藥；（2）確定最適抑制濃度；（3）確定抗生素在培養(yǎng)基上的作用和穩(wěn)定性；（4）確定抗生素不會對植物造成傷害或突變。例如，可在培養(yǎng)基加入1 mL/L的慶大霉素。

3.4 接種后嚴(yán)格管理

3.4.1 嚴(yán)禁非工作人員出入，工作人員入內(nèi)時(shí)必須穿戴清潔工作服并套鞋套(或?qū)Ｓ猛闲?，以控制外界雜菌傳入無菌區(qū)。

3.4.2 培養(yǎng)室內(nèi)光照控制在2000～3000 Lx，每天20～25℃光照16 h。每隔一周用甲醛熏蒸消毒一次，具體做法是將50 mL甲醛倒入15 g左右高錳酸鉀中,密閉接種室門窗24 h，可殺死空氣中的污染菌源。

3.4.3 及時(shí)挑出培養(yǎng)室被污染的瓶苗，然后將污染苗用高壓鍋滅菌后。集中遠(yuǎn)距離深埋，徹底消滅再侵染源。當(dāng)特別珍貴、稀少的資源被污染時(shí),如果污染程度較輕，可以對其進(jìn)行挽救，方法是：先將瓶苗移出培養(yǎng)室,然后用酒精棉將污染處蓋住,用無菌操作剪將未污染的部分剪下來，先用75%的酒精沖洗30 s,再用無菌水沖洗2次,容器表面消毒后移入超凈工作臺,再用0.1%的Hg2CL2浸泡4～10 min,最后用無菌水沖洗3～5次后轉(zhuǎn)接到新培養(yǎng)基上。處理后的材料要與其他脫毒苗分開放置,觀察一段時(shí)間確定無污染再放回原處保存。