用豬小腸細(xì)胞外基質(zhì)膜(ECM）修復(fù)家兔缺損胸壁的實(shí)驗(yàn)研究

吳金鳳,薛錦儒,崔建華*

(1.長(zhǎng)春大學(xué)醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130022;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科,吉林長(zhǎng)春 130033）

天然的細(xì)胞外基質(zhì)膜(ECM）亦稱脫細(xì)胞基質(zhì)膜或組織支架,主要取自動(dòng)物的小腸或膀胱,是一種去除細(xì)胞成分的基質(zhì)膜,主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型膠原和絲蛋白構(gòu)成。用ECM修復(fù)因傷病所致的組織缺損,不僅能恢復(fù)其解剖形態(tài)還能隨著宿主組織器官的生長(zhǎng)而生長(zhǎng),從而恢復(fù)或部分恢復(fù)所修復(fù)器官的生理功能,因此ECM組織支架的應(yīng)用正在為外科學(xué)的發(fā)展提供一個(gè)全新的理念和更廣闊的拓展空間。

胸壁腫瘤、外傷所造成的胸壁部分缺失、肺癌或乳腺癌侵及胸壁,乳癌術(shù)后過(guò)度放療等原因造成胸壁缺損的情況,在臨床上并非少見[1]。傳統(tǒng)的方法多以人工材料修復(fù)或以轉(zhuǎn)移皮瓣、帶血管蒂的游離肌皮瓣修復(fù)。然而,前者修復(fù)范圍有限,后者又以犧牲一部分健康組織為前提,有“拆東墻補(bǔ)西墻”之虞。用組織工程的方法制成ECM膜片修復(fù)胸壁缺損,是近年來(lái)國(guó)外研究的新熱點(diǎn),在以往的研究中多主張用“三明治方法”雙層修復(fù),但由于不同的胸壁組織所承擔(dān)的生理功能不同,細(xì)胞生長(zhǎng)與組織愈合周期也不同,因此對(duì)不同的胸壁組織如胸膜、肌肉組織、骨組織等分別加以修復(fù)似乎更為合理,我們用家兔為動(dòng)物模型對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 豬小腸ECM的制取、滅菌與保存

體重30-40 kg的地產(chǎn)雜種豬6頭,全麻下氣管插管機(jī)械通氣,按無(wú)菌手術(shù)的要求剃毛備皮。正中開腹切取屈氏韌帶遠(yuǎn)側(cè)小腸100 cm,以生理鹽水沖洗腸內(nèi)容,按10 cm長(zhǎng)度將小腸分割成10段,浸于4℃生理鹽水中。每段小腸從側(cè)方剖開,在特制的裝置固定下,以自制的刮除器仔細(xì)剔除小腸粘膜與漿肌層,取出ECM。將4層ECM擠壓成膜片并經(jīng)真空凍干24小時(shí),裝入密封的塑料袋中。經(jīng)直線加速以8000拉德放射劑量照射滅菌后,常溫下保存。

1.2 用豬小腸ECM膜片修復(fù)兔的缺損胸壁

新西蘭白兔12只,雌雄兼用,體重5-8 kg,分為2組。肌注開他敏(1 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉,氣管插管吸入乙氟醚維持麻醉。動(dòng)物剔毛,胸部皮膚消毒鋪無(wú)菌巾。在右胸中部包括5-7肋骨,分層依次切除皮膚、皮下組織、胸肌、肋骨、胸膜進(jìn)入胸腔,電凝止血,造成胸壁直徑3.5 cm缺損。實(shí)驗(yàn)組:剪取3.5×3.5 ECM膜片,從內(nèi)到外依次分3層分別修復(fù)胸膜和肋間肌及肋骨、胸肌、皮下組織與皮膚,其中肋骨的修復(fù)是先將ECM縫成管狀,從兩端將肋骨套入,再敷以生物膠,縫線選用6-0 Proline線。對(duì)照組:剪取3.5×3.5 ECM 膜片,用雙層“三明治法”縫合,內(nèi)層襯于胸膜,外層覆于皮膚,以6-0 Proline線均勻縫合8針,最后一針結(jié)扎前經(jīng)氣管插管吹肺,使右肺充分膨脹,兩組均未放置胸腔引流管。術(shù)后經(jīng)靜脈給予頭孢氨芐(35 mg/kg）一次/日,持續(xù)7天。術(shù)后60天將動(dòng)物處死,切取胸壁修復(fù)處標(biāo)本,運(yùn)用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生物力學(xué)等方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在胸壁缺損修復(fù)處切取組織標(biāo)本。組織學(xué)標(biāo)本以40%甲醛固定,石蠟包埋,制成3 μ m石蠟切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。由于新生的胸膜與肋間肌以及新生的肋骨已經(jīng)成為一體,難以分離解剖,因此兩組靜態(tài)單軸力學(xué)測(cè)試標(biāo)本分別取自再生胸壁的內(nèi)層和外層,游標(biāo)卡尺測(cè)量其厚度(0.5±0.1）mm,將其浸泡于25℃緩沖液中固定在Instron5848力學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上,夾持間距8 mm,以5mm/min速度拉伸,再通過(guò)曲線計(jì)算最大負(fù)荷和最大應(yīng)力。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理;檢測(cè)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較分別行t檢驗(yàn)和 χ2檢驗(yàn),以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果

24只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活到術(shù)后60天,無(wú)明顯感染,飲食體重均正常。

2.1 大體觀察兩組動(dòng)物胸壁缺損處ECM補(bǔ)片已無(wú)法辨認(rèn),組織生長(zhǎng)平展、均呈瘢痕樣愈合,無(wú)毛發(fā)生長(zhǎng),未見反常呼吸運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組缺損修復(fù)處胸壁明顯比對(duì)照組厚,前者為4.31±0.14 mm;后者為3.58±0.11 mm(P＜0.05）。

2.2 組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組鏡下均難以區(qū)分不同組織結(jié)構(gòu),纖維密度均勻,排列規(guī)則,與周圍組織分界不清,靠近邊緣處肌纖維增多,并見到較多的鱗狀上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在實(shí)驗(yàn)組切片鏡下見到條狀和橋狀鈣化,均出現(xiàn)在橫切面的中央,相當(dāng)于肋骨的深度,而對(duì)照組均未見鈣化現(xiàn)象。

2.3 生物力學(xué)觀察由于肉眼難以區(qū)分不同組織結(jié)構(gòu),兩組間生物力學(xué)測(cè)試標(biāo)本分別取自相當(dāng)于胸膜和肋間肌及肋骨床的內(nèi)層;相當(dāng)于胸肌和皮膚的外層。內(nèi)層測(cè)試最大負(fù)荷:實(shí)驗(yàn)組為8.46±1.01(N）;對(duì)照組為6.49±0.47(N）(P＜0.05）;外層測(cè)試最大負(fù)荷:實(shí)驗(yàn)組為5.32±0.76(N）;對(duì)照組為5.07±0.85(N）(P＞0.05）。內(nèi)層測(cè)試最大應(yīng)力:實(shí)驗(yàn)組為3.22±0.11(MPa）;對(duì)照組為2.13±0.27(MPa）(P＜0.05）;外層測(cè)試最大應(yīng)力:實(shí)驗(yàn)組為3.32±0.76(N）;對(duì)照組為3.07±0.85(N）(P＞0.05）。

3 討論

外科治療胸壁缺損,傳統(tǒng)上都是用自身正常組織進(jìn)行修復(fù),或是用人工合成的高分子材料修復(fù)。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展,這種以犧牲部分健康組織為代價(jià)的“以傷療傷”的理念正在被改變;而以人工合成材料修復(fù)病損的方法也存在一系列的缺陷,尤其是合成材料不能隨宿主組織器官的生長(zhǎng)而相應(yīng)增長(zhǎng),因此限制了它們?cè)谀暧撞∪梭w內(nèi)的應(yīng)用,或是在年幼病人成長(zhǎng)過(guò)程中需再次乃至多次更換人工合成材料。ECM是一種良好的組織工程材料,來(lái)源于異種動(dòng)物的ECM具有取材廣泛,滅菌后可長(zhǎng)期保存,可進(jìn)行商品化生產(chǎn)等特點(diǎn),可應(yīng)用于外科創(chuàng)傷、燒傷、整形、器官修復(fù)等多個(gè)領(lǐng)域,由于去除了細(xì)胞成分,ECM不具有抗原性[2-4]。我們用豬的小腸制取ECM,因?yàn)?1）從分子生物學(xué)的角度來(lái)看,豬的基因組與人類相近;(2）豬的來(lái)源豐富;(3）豬的生長(zhǎng)過(guò)程可人為控制,取自不同體重和不同成熟狀態(tài)豬的小腸ECM可用于不同年齡段和不同體重的病人。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出,ECM植入體內(nèi)后起到組織支架的作用[5-6],其周圍的相鄰組織細(xì)胞可以沿組織支架移行和生長(zhǎng),最終將胸壁的缺損完全修復(fù)。然而不同的組織細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同,肌肉組織和皮膚生長(zhǎng)速度似乎較骨組織和胸膜組織生長(zhǎng)更快些,因此鏡下見到較多的橫紋肌細(xì)胞和皮膚再生的鱗狀細(xì)胞,代表胸膜再生的間皮細(xì)胞未見到,而代表肋骨再生的鏡下所見僅在實(shí)驗(yàn)組見到條狀和橋狀鈣化。其次,不同的外科修復(fù)方式也影響修復(fù)的結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組將胸壁不同的組織分別加以修復(fù),結(jié)果胸壁缺損處明顯厚于對(duì)照組(P＜0.05）,生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果也表明,分別加以修復(fù)者,其胸壁內(nèi)層負(fù)荷-應(yīng)變力優(yōu)于對(duì)照組,說(shuō)明用此種方法修復(fù)缺損的胸壁,對(duì)胸壁順應(yīng)性的影響小。胸壁的構(gòu)建不僅需要封閉創(chuàng)口,還需要構(gòu)建骨性胸廓,后者對(duì)于維持正常的胸壁順應(yīng)性和呼吸功能具有重要意義。實(shí)驗(yàn)組切片上見到的鈣化,說(shuō)明在ECM的誘導(dǎo)下,肋骨的再生是可以實(shí)現(xiàn)的。因此本實(shí)驗(yàn)可以得出這樣的結(jié)論:不同的胸壁組織分別用ECM加以修復(fù),明顯優(yōu)于內(nèi)外兩層“三明治”式的修復(fù)方法。尚需說(shuō)明,無(wú)論采取何種修復(fù)方式對(duì)毛囊再生均無(wú)影響,因?yàn)閮山M在缺損修復(fù)處均未見到新生的毛發(fā)。

國(guó)內(nèi)外用ECM修復(fù)胸壁缺損仍處于臨床前研究階段,要真正用于臨床還有許多問(wèn)題需要解決,譬如:在修復(fù)胸壁的過(guò)程中需要多長(zhǎng)時(shí)間ECM可吸收殆盡?ECM最大可修復(fù)的范圍占胸壁的百分比是多少?胸壁兩種不同修復(fù)方式對(duì)呼吸功能的影響有何不同?對(duì)這些需要在今后的研究中進(jìn)一步加以證明。

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