飼用α-半乳糖苷酶酶活穩(wěn)定性的研究

楊志強(qiáng) 師昆景 于鋒

隨著生物技術(shù)、酶制劑工程和生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展，酶制劑已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋豬、雞、反芻動(dòng)物、水產(chǎn)動(dòng)物和特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖[1-3]。飼用酶制劑作為一類高效、無(wú)毒副作用和環(huán)保的“綠色”飼料添加劑，在動(dòng)物生產(chǎn)中，飼用酶制劑能顯著提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化利用率、降低飼養(yǎng)成本[4-5]。而在飼用酶制劑應(yīng)用過(guò)程中，最常遇到的問(wèn)題就是酶活穩(wěn)定性的問(wèn)題[6-7]，如在生產(chǎn)加工過(guò)程和儲(chǔ)存過(guò)程中，溫度、pH值、載體等都會(huì)影響酶活的穩(wěn)定性，最終直接影響酶的應(yīng)用效果。

α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase,EC 3.2.1.22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷水解酶。能水解非還原性末端以α-1，6鍵結(jié)合的半乳糖苷化合物,因此它能水解豆科植物種子的α-半乳糖苷類低聚糖，如棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等。大量研究表明，將該酶添加于含大豆粕的畜禽飼料中，可有效降解餅粕類飼料原料中α-半乳糖苷物質(zhì)，消除由α-半乳糖苷類物質(zhì)引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時(shí)還能促進(jìn)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、提高動(dòng)物免疫能力和促進(jìn)腸道有益微生物增殖[8-11]。本文研究α-半乳糖苷酶在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中酶活穩(wěn)定性，為該酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

α-半乳糖苷酶液體制劑，由山東思諾拜特生物科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 α-半乳糖苷酶活力單位的定義

37℃、pH值5.5條件下，每分鐘10 mmol/l對(duì)硝基酚-α-D吡喃半乳糖中降解釋放1 μmol對(duì)硝基酚所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.2 α-半乳糖苷酶酶活測(cè)定方法

將稀釋酶液和底物對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液于37℃下振蕩10 min預(yù)熱。然后再吸取各溶液0.1 ml，充分混合，于37℃恒溫振蕩10 min，加入0.8 ml碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，以蒸餾水調(diào)零，在400 nm處測(cè)定吸光度OD值。

1.2.3 α-半乳糖苷酶酶活力穩(wěn)定性的測(cè)定

1.2.3.1 不同載體對(duì)酶活力的影響

取20 ml酶液分別與50 g載體碳酸鈣、硅藻土、元明粉、滑石粉、稻殼粉、玉米皮粉和淀粉混合均勻后自然晾干并粉碎，當(dāng)水分小于10%時(shí)，按常規(guī)方法測(cè)定酶活力。以原酶液作為對(duì)照，計(jì)算酶活存留率。

1.2.3.2 高溫對(duì)酶活的影響

取20 ml酶液與50 g淀粉（含水量14%）載體混合均勻后自然晾干，物料濕度控制在17%，分別在溫度60、65、70、75、80、85、90℃條件測(cè)定α-半乳糖苷酶活力，以原酶液作為對(duì)照，計(jì)算酶活存留率。

1.2.3.3 保存時(shí)酶液的pH值對(duì)酶活的影響

將原酶液（pH值5.1）的pH值用醋酸—醋酸鈉緩沖溶液(pH值3.6～5.6，0.05 mol/l)調(diào)整為4.4、4.7、5.0、5.3和5.6，保存7 d。按常規(guī)方法測(cè)定酶活力。計(jì)算酶活存留率。以原酶液作為對(duì)照，計(jì)算酶活存留率。

1.2.3.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

分別配制Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Na+、K+和Mg2+金屬離子溶液，上述離子分別與酶液混合組成金屬離子濃度為0.2 mmol/l的溶液，于37℃恒溫水浴4 h，然后按常規(guī)方法測(cè)定酶活力，以原酶液（900 U/ml）作為對(duì)照，計(jì)算酶活存留率。

1.2.3 .5保護(hù)劑對(duì)酶活力的影響

在10 ml原酶液中分別加入1%、3%、5%和7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）4種濃度的NaCl、甘露醇、山梨醇、甘油保護(hù)劑。保存7 d。按常規(guī)方法測(cè)定不同濃度的保護(hù)劑下酶活力。以每組酶液活性最高作為對(duì)照，計(jì)算酶活存留率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同載體對(duì)酶活力的影響（見(jiàn)表1）

酶制劑的后處理工藝中采用將酶吸附在不溶性載體上時(shí)酶穩(wěn)定化的主要方法。載體的成分對(duì)酶活力的影響非常大，理想的載體有助于酶與飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的結(jié)合，提高酶的利用率。表1表明，無(wú)機(jī)載體對(duì)α-半乳糖苷酶活性影響很大，尤其是碳酸鈣、元明粉和滑石粉，收率均為0%；有機(jī)載體中玉米皮粉效果最好，收率可高達(dá)90.83%；其次是淀粉，收率為61.11%；以稻殼粉為載體的收率低于以淀粉為載體的收率，僅為44.72%。

表1 不同載體對(duì)酶活力的影響

2.2 高溫對(duì)酶活的影響（見(jiàn)表2及圖1）

在酶制劑生產(chǎn)過(guò)程中，溫度和濕度對(duì)酶活有影響。從圖1可以看出，隨著溫度的升高，酶活存留率呈下降趨勢(shì)。表2表明，物料濕度為17%，溫度小于90℃，酶活損失率小于10%，說(shuō)明該酶有較強(qiáng)的耐溫能力，溫度為90℃時(shí)，酶活損失率達(dá)到16.2%，隨著溫度上升，酶活損失率開(kāi)始增加，不利于酶活的穩(wěn)定。

表2 高溫對(duì)酶活的影響

圖1 高溫對(duì)酶活的影響

2.3 金屬離子對(duì)酶活的影響（見(jiàn)表3）

表3 金屬離子對(duì)酶活的影響

從表3可以看出，不同金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶的活性都有一定的影響，其中Cu2+可以抑制α-半乳糖苷酶的活性，37℃恒溫水浴4 h后活性存留率僅為74%，其他金屬離子對(duì)α-半乳糖苷酶有幾近相同的保護(hù)作用，37℃恒溫水浴4 h后活性存留率均大于92%，未加任何金屬離子的酶原液活性存留率為87.11%。

2.4 保存時(shí)酶液的pH值對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響（見(jiàn)表4及圖2）

在酶的保存過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)整酶液的酸堿度，增加酶活保存時(shí)間和防止雜菌生長(zhǎng)。表4表明，以原酶液（pH值5.1）為標(biāo)準(zhǔn)，最適保存pH值為5.3。pH值為4.4時(shí)，酶活損失率達(dá)到30.1%，不利于酶的保存。pH值為5.6時(shí)，酶活損失率為3.77%，有利于酶的保存，pH值在4.7～5.6之間，酶活損失率小于10%，有利于酶的保存。圖2顯示酶活損失率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)酸和過(guò)堿都不利于酶的保存。

表4 保存時(shí)酶液的pH值對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響

圖2 反應(yīng)pH值對(duì)酶活的影響

2.5 保護(hù)劑對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響（見(jiàn)表5及圖3）

液體酶成品需要加入各種保護(hù)劑以防止雜菌生長(zhǎng)和保存酶活。NaCl、甘露醇、山梨醇和甘油是最常見(jiàn)的保護(hù)劑，能穩(wěn)定酶液pH值和提高酶液的穩(wěn)定性。從表5可以看出，1%NaCl、1%甘露醇、5%和7%的山梨醇都有雜菌產(chǎn)生，不利于酶的保存；3%～5%的NaCl酶活損失小于10%、1%和5%～7%的甘油酶活損失率小于5%，都有利于酶活保存。圖3表明，NaCl和甘油對(duì)酶活保存呈先上升后下降的趨勢(shì)；甘露醇對(duì)酶活保存呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)；山梨醇呈上升趨勢(shì)，但濃度高于5%時(shí)，有雜菌產(chǎn)生，不利于酶活的保存。綜上所述，3%的山梨醇、5%NaCl、5%甘露醇和7%甘油對(duì)酶活性有較好的保護(hù)作用。

表5 保護(hù)劑對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響

圖3 保護(hù)劑對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響

3 討論

目前，常用的飼用酶制劑載體—般分為兩大類：①有機(jī)載體，主要是含粗纖維較多的植物及糧食副產(chǎn)品，如玉米麩、玉米芯粉、玉米胚芽粕粉、脫脂米糠、稻殼粉、花生殼粉、豆秸粉等，另外還有些含纖維少的物料，如淀粉、面粉、乳糖等。目前飼用酶制劑載體多使用有機(jī)載體。②無(wú)機(jī)載體一般指無(wú)機(jī)鹽類，如石粉、滑石粉、沸石粉、海泡粉、磷酸氫鈣等。作為承載飼用酶的載體，載體的理化性質(zhì)如穩(wěn)定性、含水量、粒度、容重、流動(dòng)性、酸堿度等均能影響飼用酶制劑的質(zhì)量。理想的載體應(yīng)有助于酶與飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的結(jié)合，降低營(yíng)養(yǎng)小分子或內(nèi)源性酶的抑制作用，能將表現(xiàn)最適pH值改變到理想值，不利于微生物生長(zhǎng)，不產(chǎn)生免疫反應(yīng)和凝血反應(yīng)等。為了獲得良好的混合效果，使飼用酶制劑更好地發(fā)揮作用，必須嚴(yán)格、準(zhǔn)確地選擇載體[12-15]。本試驗(yàn)表明，不同載體的使用效果，有機(jī)載體＞無(wú)機(jī)載體,有機(jī)載體中玉米皮粉＞淀粉＞稻殼粉。

酶是一種生物活性催化劑，其催化效率在一定范圍內(nèi)隨溫度升高而增加，但酶蛋白又會(huì)隨溫度升高逐漸變性而喪失催化活性。同時(shí)酶制劑發(fā)生催化反應(yīng)均以水為介質(zhì)，酶制劑穩(wěn)定性受水分的影響很大。進(jìn)一步研究以淀粉為載體，高溫、高濕對(duì)酶活的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，保持物料濕度為17%，溫度小于85℃，酶活損失率小于10%，說(shuō)明該酶有較強(qiáng)的耐溫能力，隨著溫度上升至90℃，酶活損失率達(dá)到16.7%，酶活損失率開(kāi)始增加，不利于酶活的穩(wěn)定。一般飼用酶制劑的加工溫度范圍為75～85℃。

關(guān)于飼用酶制劑在加工和使用過(guò)程中，日糧和胃腸道中金屬離子對(duì)酶活的影響[16]，本文研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對(duì)該酶有抑制作用，其他金屬離子有幾近相同的保護(hù)作用。37℃恒溫水浴4 h后，加入Cu2+酶液酶活存留率僅為74%，其他酶活存留率均大于92%。酶液保存中，可以通過(guò)調(diào)整酶液的酸堿度，增加酶活保存時(shí)間和防止雜菌生長(zhǎng)。本文研究發(fā)現(xiàn)，該酶液最適保存pH值為5.3。pH值＜4.4時(shí)，不利于酶的保存；pH值在4.7～5.6之間，酶活損失率小于10%，有利于酶的保存。同時(shí)，在酶的保存中還需要加入一些保護(hù)劑來(lái)增加酶活的穩(wěn)定。如加入無(wú)機(jī)鹽類，一方面鹽離子對(duì)酶分子的疏水殘基有“鹽析”效應(yīng)；另一方面鹽離子能結(jié)合酶分子中配對(duì)陰離子，使分子內(nèi)的靜電排斥作用降至最低，從而穩(wěn)定酶的構(gòu)象。加入一些高分子化合物，如醇類，醇類的羥基基團(tuán)和酶分子的相互作用或醇類本身可以減少了介質(zhì)的介電常數(shù)，加強(qiáng)了酶分子的疏水作用，進(jìn)而提高了酶的穩(wěn)定性[17]。在酶低溫保存中，加入甘油和多元醇還對(duì)酶有保護(hù)作用。研究不同濃度的保護(hù)劑對(duì)酶活影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入1%NaCl、1%甘露醇、5%和7%的山梨醇都有雜菌產(chǎn)生，不利于酶的保存；加入3%～5%的NaCl、5%甘露醇、1%和5%～7%的甘油都有利于酶活保存。其中5%NaCl、5%甘露醇和7%甘油對(duì)酶活性的保護(hù)作用最好。

影響酶穩(wěn)定性的因素很多，而且非常復(fù)雜。同一載體的不同理化性質(zhì)對(duì)酶活產(chǎn)生影響；同一金屬離子在不同濃度下對(duì)酶活可表現(xiàn)出激活或抑制作用；不同離子之間還存在著互作效應(yīng)；不同保護(hù)劑之間也存在相互作用。諸多因素都會(huì)對(duì)酶活的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步研究。

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