基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的外源基因表達(dá)系統(tǒng)的評價(jià)和應(yīng)用

葉玲玲，許建，李世崇，劉紅，劉興茂，王啟偉，陳昭烈

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，北京 100021

生物技術(shù)藥物是 21世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域中引人關(guān)注的研究和產(chǎn)業(yè)熱點(diǎn)。目前，采用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白藥物已經(jīng)成為生物制藥產(chǎn)業(yè)的主流，其市場份額已超過全球生物技術(shù)藥物銷售額的 2/3[1-2]。在以哺乳動物細(xì)胞為生產(chǎn)系統(tǒng)的重組蛋白藥物的生產(chǎn)中，獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)外源目的蛋白的細(xì)胞系是其中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[3-4]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)通常由包膜蛋白載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細(xì)胞時(shí)，具有傾向發(fā)生于染色體開放區(qū)和轉(zhuǎn)錄活躍位點(diǎn)的明顯特點(diǎn)[5-6]。這一基因整合特性能有效地將外源目的基因整合入靶細(xì)胞基因組并使之穩(wěn)定高效地表達(dá)。同時(shí)，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒可以與多種細(xì)胞表面蛋白結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，其宿主細(xì)胞范圍很廣，具有感染終末分化細(xì)胞的能力，使其成為基因治療研究、RNA干擾和基因功能研究中廣泛采用的基因轉(zhuǎn)移載體[7-9]。

2005年，Bleck采用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了抗體表達(dá)水平達(dá)到1.6 g/L的CHO細(xì)胞系[10]。這一結(jié)果提示逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)有望成為構(gòu)建高效、穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的工程細(xì)胞系的新的技術(shù)途徑?；诖耍狙芯恳栽鰪?qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 基因的表達(dá)水平和穩(wěn)定性為指標(biāo)，考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pQCXIN介導(dǎo)的外源基因在HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞的表達(dá)效率，并采用 pQCXIN載體構(gòu)建了高效表達(dá)人重組活性蛋白 C (Recombinant human activated protein C，rhAPC) 的HEK293細(xì)胞系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

HEK293細(xì)胞和質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)、大腸桿菌DH5α均購自美國Invitrogen公司；CHO-K1細(xì)胞購自美國ATCC；逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pQCXIN、包膜蛋白載體pVSV-G和病毒包裝細(xì)胞GP2-293均購自美國 Clontech公司；質(zhì)粒 pcDNA3.1/EGFP和pcDNA3.1/rhPC由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶購自美國NEB公司；DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化回收試劑盒購自美國 Qiagen公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國 Invitrogen公司；G418購自德國Merck公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國HyClone公司；蛋白C標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白C兔多克隆抗體購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自上海萊博生物公司。

1.3 攜帶外源基因的pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

EGFP cDNA和 rhAPC cDNA分別從質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP和 pcDNA3.1/rhPC中經(jīng) AgeⅠ/ PacⅠ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳分離、膠回收純化，雙粘端連入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 pQCXIN，構(gòu)建攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pQCXIN/EGFP和攜帶 rhAPC基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pQCXIN/rhAPC。

1.4 攜帶外源基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備和滴定

GP2-293細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2貼壁生長于75 cm2培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞的匯合度達(dá)到 90%時(shí)，分別用pQCXIN/EGFP和 pVSV-G、pQCXIN/rhPC 和pVSV-G進(jìn)行雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。二質(zhì)粒摩爾比為1∶1，總量20 μg，轉(zhuǎn)染后5 h后更換新鮮的含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基，48 h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清。細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.45 μm濾膜濾器過濾除去細(xì)胞碎片后，50 000×g、4 ℃超速離心1.5 h，倒掉上清，按100倍濃縮加入含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮沉淀，?70 ℃超低溫冷柜保存。病毒滴定參照文獻(xiàn)進(jìn)行，并將病毒滴度定義為 GTU/mL (Gene transfer unit per ml)[11]。濃縮后的病毒滴度為1×107~2×107GTU/mL。

1.5 HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選

1.5.1 陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

參照 LipofectamineTM2000說明書，轉(zhuǎn)染前1天分別將HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞以7.5×105細(xì)胞/孔接種6孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞形成 80%~90%的匯合細(xì)胞層，轉(zhuǎn)染前更換不含血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基。取 10 μg質(zhì)粒pcDNA3.1/EGFP或 pcDNA3.1/rhPC用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至 250 μL；用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋10 μL LipofectamineTM2000至250 μL。將上述兩種液體移入同一EP管中混勻，室溫避光放置20 min后分別加入對應(yīng)的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)6 h后補(bǔ)加含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞感染

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染前1天分別將HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞以7.5×105細(xì)胞/孔接種6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞形成80%~90%的匯合細(xì)胞層，感染前更換含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。取200 μL逆轉(zhuǎn)錄病毒pQCXIN/EGFP或 pQCXIN/rhAPC分別加入對應(yīng)的6孔板中搖勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 6 h后更換含 10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.3 轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的篩選和單克隆化

轉(zhuǎn)染24 h后，用0.25% (W/V) 胰蛋白酶消化HEK293細(xì)胞并將各孔細(xì)胞分別接種至 24孔板，4~5 h細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)基換為含0.6 g/L G418和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。3~4 d換液1次。直到2周后陽性克隆長出。胰酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于外源基因表達(dá)強(qiáng)度分析；或采用有限稀釋法將細(xì)胞接種于 96孔板克隆生長、篩選 rhAPC高效表達(dá)HEK293細(xì)胞系。

1.6 測定和分析方法

采用 Cedex AS20細(xì)胞密度和活力自動分析系統(tǒng) (Innovatis，Germany) 計(jì)數(shù)活細(xì)胞密度。采用流式細(xì)胞儀 (BD FACSCalibur，USA) 分析質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞 EGFP的相對熒光強(qiáng)度(Relative fluorescence intensity，RFI)，每個(gè)檢測樣品的細(xì)胞總數(shù)設(shè)定為30 000。轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞的rhAPC表達(dá)水平分析參照文獻(xiàn)采用ELISA法進(jìn)行[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

選用 AgeⅠ和 PacⅠ位點(diǎn)作為EGFP cDNA和rhAPC cDNA的克隆位點(diǎn)，分別將EGFP cDNA和rhAPC cDNA連入pQCXIN中，正確質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖1A、1B所示，命名為 pQCXIN/EGFP和 pQCXIN/ rhAPC。所構(gòu)建的表達(dá)載體經(jīng) AgeⅠ、PacⅠ酶切鑒定，分別出現(xiàn)與預(yù)期一致、長度約為700 bp和1 300 bp的片段 (圖2)。該結(jié)果經(jīng)進(jìn)一步的測序分析得到證實(shí)。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的EGFP表達(dá)效率

圖1 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Diagrams of recombinant retroviral vectors. (A) pQCXIN/EGFP retroviral vector. (B) pQCXIN/rhAPC retroviral vector.

圖2 pQCXIN逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant retroviral vectors by enzyme digestion. 1: pQCXIN/rhAPC retroviral vector digested with Age I and Pac I; 2: pQCXIN/EGFP retroviral vector digested with Age I and Pac I; M: DNA marker.

分別用pcDNA3.1/EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞，以及用經(jīng)由pQCXIN/EGFP和pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞制備的攜帶EGFP基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染的 HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞，經(jīng)過400 mg/L G418加壓篩選2周，收集細(xì)胞進(jìn)行流式分析，考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的EGFP表達(dá)效果。HEK293細(xì)胞經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染后，EGFP表達(dá)陽性細(xì)胞比例基本相同，約占細(xì)胞總數(shù)的 80%左右 (圖 3A、B)；病毒感染CHO-K1的 EGFP表達(dá)陽性細(xì)胞比例則明顯高于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 CHO-K1細(xì)胞 (圖 3C、D)。定量分析EGFP表達(dá)陽性細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度，病毒感染HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞的RFI均約為對應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的2倍 (圖3E)。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體反復(fù)感染HEK293細(xì)胞的EGFP表達(dá)

將經(jīng)由 pQCXIN/EGFP和 pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞制備的攜帶 EGFP基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒一次感染后的HEK293細(xì)胞的RFI值設(shè)定為1，并據(jù)此考察逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體多輪反復(fù)感染HEK293細(xì)胞的EGFP表達(dá)。圖4為HEK293細(xì)胞經(jīng) 2~4輪逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體反復(fù)感染后流式細(xì)胞分析的RFI相對值。RFI的相對值隨逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體感染次數(shù)的增加而升高，4輪病毒感染HEK293細(xì)胞的RFI值較1次病毒感染HEK293細(xì)胞的RFI值約提高2倍 (圖4)。結(jié)果提示，多輪反復(fù)感染逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體能通過增加HEK293細(xì)胞中EGFP基因的拷貝數(shù)提高EGFP的表達(dá)效率。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的 EGFP表達(dá)穩(wěn)定性

表1為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體感染的HEK293細(xì)胞在撤除 G418篩選壓力后連續(xù)傳代過程中的RFI值變化。經(jīng)過6次連續(xù)傳代，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的RFI值由290.47降至88.89，下降幅度為 69.4%；經(jīng)過 1到 4輪病毒感染 HEK293細(xì)胞的RFI值的下降幅度分別為44.5%、22.4%、37.5%和 21.5%。結(jié)果提示，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性優(yōu)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)。

圖3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染介導(dǎo)的EGFP在HEK293細(xì)胞和CHO-K1細(xì)胞表達(dá)的流式細(xì)胞分析Fig. 3 Analysis the effect of EGFP expression in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. (A) Plasmid transfected HEK293 cells. (B) Virus infected HEK293 cells. (C) Plasmid transfected CHO-K1 cells. (D) Virus infected CHO-K1 cells. (E) RFI in both HEK293 and CHO-K1 cells via plasmid transfection or virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment. EGFP: enhanced green fluorescent protein.

圖4 HEK293細(xì)胞經(jīng)多輪反復(fù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的EGFP表達(dá)情況Fig. 4 EGFP expression of the HEK293 cells with repeated virus infection. Results are expressed as the mean value of duplicate samples from different experiment.

2.5 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的rhAPC高效表達(dá)

分別用經(jīng)由pQCXIN/rhAPC和pVSV-G共轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞制備的攜帶rhAPC基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 HEK293細(xì)胞和 pcDNA3.1/rhAPC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。經(jīng)過400 mg/L G418加壓篩選2周，病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的rhAPC表達(dá)水平分別為326.4 ng/(106cells·d) 和8.6 ng/(106cells·d)，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的rhAPC效率明顯高于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的rhAPC表達(dá) (表2)。在96孔板采用有限稀釋法對病毒感染HEK293細(xì)胞進(jìn)行克隆并經(jīng)ELISA篩選，獲得了3株rhAPC表達(dá)水平為10~15 μg/(106cells·d) 的HEK293細(xì)胞系。

3 討論

HEK293細(xì)胞為來源于人胚胎的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，其不僅體外培養(yǎng)性狀良好，且不存在嚙齒類病毒感染的潛在威脅。此外，HEK293細(xì)胞具有CHO細(xì)胞缺乏的γ-羧基化修飾和有效水解原肽以及表達(dá)完全人型塘基化的重組蛋白的能力。HEK293細(xì)胞的上述優(yōu)點(diǎn)使其成為日益受到重視的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)，采用HEK293細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白藥物和重組腺病毒載體也已分別獲得FDA和SFDA的批準(zhǔn)上市[3]。

表1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染的HEK293細(xì)胞在連續(xù)傳代過程中的RFI值變化Table 1 Change of RFI of both plasmid transfected and virus infected HEK293 cells during continuous passage

表2 ELISA檢測病毒感染和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的rhAPC表達(dá)水平Table 2 rhAPC expression in HEK293 cells infected by retrovirus or transfected by recombinant plasmid by ELISA

哺乳動物細(xì)胞的基因組非常龐大，其中包含為數(shù)眾多的外源基因整合位點(diǎn)，如CHO細(xì)胞基因組中大概有15 000個(gè)整合位點(diǎn)，但其中能使外源基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活躍位點(diǎn)為數(shù)不多，大約只有15個(gè)位點(diǎn)[13]。通常的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等方法只能將外源目的基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，因此，即使經(jīng)過大量的篩選，獲得高效表達(dá)外源目的基因的細(xì)胞系的幾率仍非常低。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的外源目的基因整合到宿主細(xì)胞時(shí)，整合位點(diǎn)通常位于DNase I高敏感性區(qū)域內(nèi)的染色體開放區(qū)和轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，這些區(qū)域與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組密切相關(guān)[14]。本研究的結(jié)果證實(shí)，對比質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的外源基因表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體在介導(dǎo)外源基因表達(dá)的效率和穩(wěn)定性方面均有明顯的優(yōu)勢。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的外源基因表達(dá)還可通過病毒的多輪感染有效地提高整合于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性區(qū)的外源基因的拷貝數(shù)。這一基因整合特性為外源目的基因的高效表達(dá)提供了可能，并由此大大提高了獲得到外源基因高效表達(dá)細(xì)胞系的幾率。雖然，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體介導(dǎo)外源基因高效表達(dá)需要以操作相對繁瑣的高滴度病毒制備為前提，但仍不失為一種有發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的、能有效提高外源基因在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)效率的技術(shù)途徑。

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