酵母成分中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

竇 明，李 博

(鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鶴壁 458030)

酵母抽提物主要成分為蛋白質(zhì)、海藻糖、多種氨基酸等，其成分復(fù)雜，根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和成分，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有兩種［1］:一種是利用蛋白質(zhì)的共性，即含氮量、肽鍵和折射率測(cè)定蛋白質(zhì)含量;另一種是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定其含量。由于酵母抽提物中除蛋白氮外，還有氨基酸等含氮物質(zhì)，故凱氏定氮法［2］不適于作為本實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，需對(duì)蛋白質(zhì)的快速、簡(jiǎn)易測(cè)定方法進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

酵母抽提物，湖北安琪酵母公司;牛白蛋白(BSA)、硫酸銅、酒石酸鉀鈉(AR)，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;微型高速離心機(jī)，南京實(shí)驗(yàn)儀器廠;721分光光度計(jì)，上海第三分析器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

試劑配制:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)牛白蛋白1.00 g(蛋白質(zhì)含量90%)加蒸餾水至100 mL，配制成10 g/L的標(biāo)準(zhǔn)牛白蛋白溶液。

雙縮脲試劑［3］:0.75 g五水硫酸銅和3 g酒石酸鉀鈉溶于250 mL蒸餾水中，加入40%氫氧化鈉溶液37.5 mL，搖勻定容至500 mL。

測(cè)定:取酵母抽提物溶液0.5 mL，加蒸餾水至1 mL，再加4 mL雙縮脲試劑，搖勻靜置。20 min，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度［4］，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取6 支試管分別加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)牛白蛋白溶液，加蒸餾水至1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑搖勻，在波長(zhǎng)550nm處測(cè)定光密度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其結(jié)果如表1、圖1。

表1 蛋白含量和光密度關(guān)系

圖1 蛋白光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，可作為酵母抽提物中蛋白質(zhì)含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 酵母抽提物蛋白質(zhì)含量測(cè)定

稱酵母9.154 g，加蒸餾水定容至100 mL，取三支試管，分別取該溶液各0.5 mL，加蒸餾水至1 mL，再加4 mL雙縮脲試劑，搖勻，靜置20 min后，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果可知，蛋白質(zhì)含量為9.06 g/L，相對(duì)偏差小于2%，準(zhǔn)確度較高，換算到酵母抽提物蛋白質(zhì)含量為9.90%。

2.3 酵母濃度對(duì)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的影響

稱酵母9.241 g，加蒸餾水搖勻定容至100 mL，取配制的溶液分別稀釋1～5倍，各取0.5 mL，加蒸餾水至1 mL，再加雙縮脲試劑4 mL，搖勻靜置20 min后在550 nm處測(cè)定光密度，求其平均含量和相對(duì)偏差，結(jié)果如表3所示。

表3 酵母抽提物濃度與蛋白質(zhì)含量

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蛋白質(zhì)含量在1.5 g/L以上，測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差小于3%，說明測(cè)定方法準(zhǔn)確，相對(duì)誤差較小;蛋白質(zhì)含量小于1.5 g/L，相對(duì)偏差較大，準(zhǔn)確度相對(duì)較差。在整個(gè)測(cè)定范圍內(nèi)，對(duì)測(cè)得的蛋白質(zhì)含量和酵母抽提物濃度進(jìn)行線性擬合得直線如圖2。

圖2 蛋白質(zhì)含量和酵母抽提物濃度關(guān)系曲線

由圖可知，蛋白質(zhì)含量和酵母抽提物近似線性關(guān)系，故可用雙縮脲法對(duì)不同酵母抽提物溶液中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

3 小結(jié)

凱氏定氮法是經(jīng)典測(cè)定總氮的方法，準(zhǔn)確、精密度高，但程序繁瑣，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，有非蛋白氮干擾時(shí)測(cè)定偏差大;雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)最小檢測(cè)含量至1.5 g/L，平行相對(duì)偏差較小，此法操作簡(jiǎn)便，適合實(shí)驗(yàn)室快速測(cè)定。

［1］馬增春，高 月，呂俊萍，等.雙向凝膠電泳中三種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的比較［J］.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2004，(4):129-134.

［2］王宗乾，程 龍，邱小永，等.凱氏定氮法測(cè)定牛奶纖維蛋白質(zhì)含量［J］. 印染，2008，(12):35-37.

［3］郭穎娜，孫 衛(wèi).蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的比較［J］.河北化工，2008，(4):40-41.

［4］沈萍萍，王朝輝，齊雨藻，等.光密度法測(cè)定微藻生物量［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2001，(3):117-121.