舌鱗狀細(xì)胞癌Survivin、VEGF表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義的研究

孫海媛 王琳 白宇宏

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔惡性腫瘤中最常見的腫瘤，一般惡性程度較高，生長快，浸潤性較強，常發(fā)生早期頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。術(shù)后5a生存率仍約為6.6％～11.7％，嚴(yán)重影響患者的身心健康，降低了生存質(zhì)量。細(xì)胞癌變源于基因異常表達(dá)，細(xì)胞處于癌變啟動階段時，細(xì)胞形態(tài)尚未發(fā)生變化，但一些酶類已開始異常表達(dá),Survivin和VEGF基因可能就是其中之一，檢測以上因子，可輔助臨床現(xiàn)行的診斷方法，為探求更加有效的治療手段提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取河北省唐山市多家醫(yī)院2000年1月～2007年12月口腔頜面外科手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本的石蠟塊45例，所有標(biāo)本皆經(jīng)病理診斷為舌鱗狀細(xì)胞癌。10例正常舌黏膜，取自舌外傷組織?；颊吣挲g：≥60歲21例，60歲24例。腫瘤組織病理學(xué)分級：20例高分化舌鱗狀細(xì)胞癌，13例中分化舌鱗狀細(xì)胞癌，12例低分化舌鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本。按照2002年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）公布的口腔癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期12例，Ⅳ期9例。在舌鱗癌標(biāo)本中，伴頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。所有患者皆未接受任何系統(tǒng)的放、化療。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD147多克隆抗體、鼠抗人VEGF多克隆抗體、pv9000兩步法免疫組化試劑盒、DAB Kit試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

所有標(biāo)本經(jīng)4％甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，片厚4m，脫蠟至水。免疫組化染色按照試劑盒說明書進行。舌鱗癌組織陰性對照以PBS代替一抗進行組織化學(xué)染色。

1.4 結(jié)果判定

所有切片均由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生，雙盲閱片，每張切片在高倍鏡（×400）下觀察5個不同視野內(nèi)的細(xì)胞CD147、VEGF染色情況，以胞漿或包膜淺黃色或棕黃色為陽性細(xì)胞，按陽性細(xì)胞占百分比及染色程度分級評分。陽性比例：10％～25％為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，＞76％為4分。染色深淺：無色為0分，淺黃為l分，黃色為2分，棕黃為3分。上述兩項相加，得分＜2分記為陰性，≥2分記為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件，舌癌病理分級之間CD147和VEGF的表達(dá)應(yīng)用x2檢驗，舌癌中CD147和VEGF的表達(dá)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Survivin、VEGF在舌鱗癌組織與正常舌組織中表達(dá)情況的比較Survivin、VEGF蛋白主要位于舌鱗癌細(xì)胞的胞漿中，為粗細(xì)不一的棕黃顆粒以中強染色為主。正常舌組織中未見Survivin、VEGF的染色，Survivin、VEGF在舌鱗癌組織中陽性表達(dá)率分別為66.7％（30/45）、71.1％（32/45），與正常舌組織間有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 VEGF在舌鱗癌中的表達(dá)與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 舌鱗組織中Survivin、VEGF的相關(guān)性

2.2 Survivin、VEGF在舌鱗癌中的表達(dá)與各種臨床病理參數(shù)的關(guān)系（表1）。

2.3 Survivin、VEGF在舌鱗癌組織的相關(guān)關(guān)系（表2）

在30例Survivin陽性表達(dá)的舌鱗癌中有26例VEGF表達(dá)陽性，占86.6％；在15例Survivin陰性表達(dá)的舌鱗癌中有6例VEGF表達(dá)陽性，占40％。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，兩者之間成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.485（P=0.0019）。

3 討論

腫瘤細(xì)胞凋亡是目前分子生物學(xué)研究的一個熱點。在生物進化過程細(xì)胞生死的程序已經(jīng)以基因的形式存儲于細(xì)胞中，同樣也存在著抑制凋亡的基因，正常情況下這兩類基因處于協(xié)調(diào)的平衡狀態(tài)，以確保細(xì)胞生死有序。Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族中的新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抑制凋亡作用最強的因子，Survivin不僅抑制細(xì)胞凋亡，還參與對細(xì)胞分裂的調(diào)控，并在血管形成過程中，對維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常增殖起重要作用[1]。本實驗中Survivin蛋白在正常粘膜不表達(dá)，而在舌鱗癌中高表達(dá)，與Tanaka等[2]對口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究是一致的，使Survivin基因成為腫瘤基因治療的一個理想的攻擊靶點。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的舌鱗癌組織中，Survivin基因的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的舌鱗癌組織（P＜0.05），這與Lo Muziol等[3]的研究結(jié)果相一致。此研究結(jié)果表明，異常表達(dá)的Survivin可能通過抑制舌癌細(xì)胞自身凋亡的過程，使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)無限制生長，Survivin對舌癌的發(fā)生、發(fā)展起著促進作用，測定舌鱗癌組織中Survivin基因的陽性表達(dá)對判斷預(yù)后有著指導(dǎo)作用。高、低分化組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期之間的表達(dá)有顯著差異（P＜0.05），均為臨床診斷、判斷預(yù)后提供了重要參考。

癌癥死亡的原因85％～95％均為轉(zhuǎn)移所致[4]，舌癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯受腫瘤的大小影響，T4較T1-3更易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[5]。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到或超過1～2mm時，經(jīng)微循環(huán)滲透提供的營養(yǎng)物質(zhì)已不能滿足腫瘤的生長需要，此時向腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)的血管逐步形成。VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的促血管生長因子，VEGF的表達(dá)與腫瘤的病程及惡性程度密切相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞不僅分泌VEGF，同時還能表達(dá)VEGF受體，VEGF能直接刺激腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。因此，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中VEGF扮演了一個重要的角色，可作為腫瘤代謝及轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Konno等[7]研究發(fā)現(xiàn)，26例大腸癌中VEGF的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，而且VEGF的表達(dá)與腫瘤的大小顯著相關(guān)。李宏捷等[8]研究顯示VEGF的表達(dá)與舌癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，進一步證實了VEGF與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。而通過阻斷VEGF抑制腫瘤血管形成，從而抑制了腫瘤的生長也為部分學(xué)者證實。

本實驗結(jié)果顯示：VEGF在舌鱗癌組織中的高表達(dá)率，說明VEGF過度表達(dá)與促血管形成有密切關(guān)系；舌鱗癌中VEGF在臨床分期Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期之間的表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）；隨著TNM分期的進展，Ⅲ、Ⅳ期舌鱗癌體積增長加快，新生血管無論從數(shù)量上還是質(zhì)量上均不能滿足腫瘤組織生長的需要。腫瘤細(xì)胞迅速生長時對氧氣的需要增加，必然導(dǎo)致缺氧，而缺氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞旁分泌VEGF。因此筆者認(rèn)為Ⅲ、Ⅳ期舌鱗癌VEGF表達(dá)的增加，與其癌的體積及浸潤深度的增加使得癌灶內(nèi)相對缺氧有關(guān)。舌鱗癌中VEGF的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組亦有顯著差異（P＜0.05），腫瘤的血道和淋巴道轉(zhuǎn)移都與血管和淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及連接方式有關(guān)。而VEGF能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促使其增殖并能增加血管的通透性。Pepper等[9]研究認(rèn)為淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的生長與血管內(nèi)皮細(xì)胞相似，均受VEGF等細(xì)胞因子的調(diào)控，VEGF同時具有促進淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生的能力。

細(xì)胞的凋亡不但與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，而且與血管的生成、腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Survivin與VEGF在腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤新生血管之間有著密切關(guān)系。O’connor[10]應(yīng)用VEGF誘導(dǎo)靜止期的內(nèi)皮細(xì)胞分裂，結(jié)果內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的Survivin表達(dá)水平上升約16倍，高表達(dá)的Survivin抑制了各種指向Caspase的凋亡機制，從而保護內(nèi)皮細(xì)胞逃避凋亡。Mehdi Mesri等[11]利用Survivin的反義核苷酸抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中Survivin的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)VEGF保護內(nèi)皮細(xì)胞功能減低。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Survivin蛋白表達(dá)與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.485,P＜0.01），表明Survivin與VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著協(xié)同作用，在免疫組化的研究水平揭示了這兩個腫瘤相關(guān)基因之間可能存在著相互調(diào)控。Survivin和VEGF表達(dá)的上調(diào)與舌癌臨床病理特征密切相關(guān)，并且存在正協(xié)同關(guān)系。因此，對二個指標(biāo)的聯(lián)合檢測有利于臨床舌癌的診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的判斷，針對二者在舌鱗癌發(fā)展及腫瘤血管形成中的相互作用機制而開發(fā)抗腫瘤藥物，或靶向Survivin和VEGF基因治療，將提供舌癌治療的新途徑。

[1]Lo Muzio L,G Pannone,S Stabano,et al.Survivin expression in oral squanous cell carcinoma[J].Br J Cancer,2003,89（12）：2244-2248.

[2]Tanaka C,Uzawa K,Shibahara T,et al.Expression of an inhibitor of apoptosis,survivin,in oral carcinogenesis[J].Dent Res,2003,82（8）：607-611.

[3]Lo Muzio L,Pannone G,Staibano S,et al.Survivin expression in oral squamous cell carcinoma[J].Br J Cancer,2003,89（12）：2244-2248.

[4]Shintani S,Matsuura H,Hasegawa Y,et al.Regional lymph node involvement affects the incidence of distant metastasis in tongue squamous cell carcinomas[J].Anticancer Research,1995,15（4）：1573-1576.

[5]徐澤.癌轉(zhuǎn)移治療新概念與新方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2006：70.

[6]Tian XJ,Song SM,Wu J,et al.Vasceular endothelial growth factor：acting as an autocrine growth factor for human gastric adenocareinoma cell MGC803[J].Biochem Biophys Res Comm,2001,286：505.

[7]Konno H,Tanaka T,Baba M,et al.Quantitative analysis of vaseular growth factor in colon cancer[J].Eur Surg Res,1998,30（4）：273-278.

[8]李宏捷,朱曉虹,張玉茹.MMP-9與VEGF在舌癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].天津醫(yī)藥,2008,36（4）：264-266.

[9]Pepper MS,Wasi S,Ferrara N,et a1.In vitro angiogenesis and proteolytic properties of bovine lymphatic endothelial ce1ls[J].Exp Cell Res，1994,210：298-306.

[10]O'connor DS,Schechner JS,Adida C,et a1.Control of apoptosis during angiogengesis by Survivin express in endothelial cell[J].Am J Patho1,2000,156（2）：393-398.

[11]Mesri M,Morales-Ruiz M,Ackermann EJ,et al.Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by Survivin targeting[J].Am J Patho1,2001,8（4）：350-310.