基于基因組DNA誘變的遺傳重組改造乙醇工業(yè)酵母的耐熱性及發(fā)酵性能

劉秀穎，何秀萍，盧瑩，張博潤

1 中國科學(xué)院微生物研究所 酵母菌分子遺傳與育種實驗室，北京 100101

2 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

燃料乙醇作為一種清潔能源得到了越來越廣泛的關(guān)注。酵母菌，尤其釀酒酵母，是以糖質(zhì)和淀粉質(zhì)為原料的乙醇發(fā)酵最經(jīng)典的菌株。野生酵母菌的最適生長和發(fā)酵溫度通常在30 ℃左右，而在工業(yè)發(fā)酵過程中常常面臨由地區(qū)或季節(jié)影響以及發(fā)酵過程本身釋放的大量熱量造成的高溫脅迫，因此溫度變化脅迫是影響酵母發(fā)酵效率的一個重要限制因素。提高酵母菌的熱耐受性以及高溫脅迫條件下的發(fā)酵性能，不但對乙醇發(fā)酵工業(yè)有重要意義，同時也將極大提高以酵母菌為發(fā)酵主體的其他發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效率。

酵母菌的熱耐受性一直是酵母菌研究和發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的熱點問題。研究人員不斷嘗試各種不同的方法和策略來實現(xiàn)對酵母菌耐熱性能的改造[1]。其中，Banat等從印度樣品中分離到能在45 ℃發(fā)酵葡萄糖的耐高溫酵母菌株[2]。Edgardo等通過溫度適應(yīng)性馴化使酵母菌株的最高生長溫度提高了 3 ℃[3]。Shimoda等建立了利用缺失校正功能的DNA聚合酶δ為誘變因子的溫度適應(yīng)性馴化策略[4]。Sakanaka等將一株耐高溫的克魯維酵母和高產(chǎn)乙醇的釀酒酵母進行融合，獲得了可以在43 ℃生長的融合菌株，但該菌株喪失了高溫發(fā)酵能力[5]。隨著對酵母菌耐熱機制理解的不斷加深，通過對酵母菌熱耐受性相關(guān)基因的操作來定向改造酵母耐高溫性能成為可能。Hiroyuki等通過過表達泛素連接酶 Rsp5和多個泛素結(jié)合酶提高了野生酵母菌株CKY8的多種脅迫耐受性，獲得在 39 ℃的熱耐受性明顯提高的重組菌株[6]。但由于酵母熱耐受性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和各菌株遺傳背景的復(fù)雜性，僅對單個或少數(shù)基因的功能進行調(diào)控，還難以獲得理想的效果。而經(jīng)典的、基于全細胞遺傳信息重組的策略對于受復(fù)雜機制調(diào)控的生理性能的改造仍然是一個重要的選擇。本研究采用化學(xué)誘變和基于基因組 DNA誘變的遺傳重組方法對乙醇工業(yè)酵母菌株進行耐熱性能改造，獲得一株耐熱性能和發(fā)酵性能提高的重組釀酒酵母菌株，為釀酒酵母在燃料乙醇高溫發(fā)酵方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae CE1~CE8均為本實驗室保存的乙醇工業(yè)酵母。

1.1.2 培養(yǎng)基和實驗試劑

酵母菌常規(guī)培養(yǎng)使用YEPD培養(yǎng)基，配方如下(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，自然pH。乙醇發(fā)酵使用EFM培養(yǎng)基，配方如下 (g/L)：酵母粉6，蛋白胨10，尿素5，磷酸二氫鉀1，水合硫酸鎂1.5，氯化鈣0.55，葡萄糖200，自然pH。

使用的其他化學(xué)試劑包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸二乙酯、硫代硫酸鈉以及山梨醇等均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)誘變

培養(yǎng)至對數(shù)中期的酵母細胞，3 000×g離心5 min收集菌體，用0.2 mol/L磷酸緩沖液 (PB，pH 5.8) 洗 2次，細胞重懸于等體積的磷酸緩沖液中，加入1% (V/V) 的DES (硫酸二乙酯)，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 40 min，加入10倍體積的5%硫代硫酸鈉終止反應(yīng)。誘變菌液進行梯度稀釋后，涂布在YEPD平板上，分別在42 ℃和43 ℃培養(yǎng)48 h[7]。

1.2.2 酵母菌總DNA的提取和遺傳轉(zhuǎn)化

酵母菌總DNA的提取參照文獻[8]進行。酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化參見文獻[9]的電擊轉(zhuǎn)化法，略有改動。將YEPD液體培養(yǎng)基中活化的酵母菌以1%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)至OD600值達到1.3~1.6。4 ℃、5 000×g離心3 min收集菌體。細胞用預(yù)冷的無菌雙蒸水和1 mol/L山梨醇溶液洗2次，4 ℃、5 000×g離心3 min收集菌體。細胞重懸于50 μL預(yù)冷的山梨醇溶液中，置于冰上備用。取40 μL上述菌液與待轉(zhuǎn)化DNA混合后移入0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴5 min，在 1.5 kV電壓下，電擊 5 ms (BIO-RAD micropulser)。電擊后立即加入0.5 mL山梨醇溶液，輕輕混勻后，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入0.5 mL YEPD液體培養(yǎng)基，30 ℃靜置孵育2 h，然后5 000×g離心3 min收集菌體，無菌水洗1次后，細胞重新懸浮于無菌水中，均勻涂布在YEPD平板上。

1.2.3 基因組DNA誘變及遺傳重組

不同菌株來源的總 DNA等量混合，加入 1% (V/V) 的DES (硫酸二乙酯)，37 ℃溫育1 h，然后通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母菌，轉(zhuǎn)化液涂布在含1 mol/L山梨醇的YEPD平板上，分別在43 ℃和44 ℃培養(yǎng)3~5 d，檢測不同單菌落的耐熱性。

1.2.4 酵母細胞的溫度適應(yīng)性分析

培養(yǎng)至對數(shù)中期的酵母細胞進行梯度稀釋，稀釋度為 10?1、10?2、10?3、10?4的菌懸液點于 YEPD平板上，在不同溫度下培養(yǎng)48 h，檢測酵母細胞對不同溫度脅迫的適應(yīng)能力。為了分析酵母細胞對熱激的耐受性，3 000× g離心5 min收集對數(shù)中期的酵母細胞，細胞重懸于等體積新鮮YEPD中，分別在48 ℃和52 ℃處理，不同時間取出100 μL菌液，梯度稀釋后涂布于YEPD平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，單菌落計數(shù)后，以0 h為對照，計算其在熱激不同時間后的存活率 (%)，來表征菌株的熱激耐受性。

1.2.5 酵母菌株遺傳穩(wěn)定性分析

酵母菌遺傳穩(wěn)定性分析按文獻[10]方法進行。將重組菌株在10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次，培養(yǎng)條件為30 ℃、24 h。將傳代10次后的菌液適當稀釋，在YEPD平板上劃線，挑取約50個單菌落，在無菌水中饑餓4 h。將饑餓過的單菌落點于YEPD平板上，分別在44 ℃和45 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并對比菌落生長情況。

1.2.6 乙醇發(fā)酵

將 YEPD斜面上活化的酵母菌株接種于 2 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)接到10 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)18 h，然后轉(zhuǎn)接到100 mL EFM培養(yǎng)基中，分別在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃條件下培養(yǎng)6 h (150 r/min)，然后進行厭氧發(fā)酵，定時取樣檢測各項發(fā)酵性能指標。每個條件重復(fù)3次，每次設(shè)3個重復(fù)。

1.2.7 葡萄糖、乙醇及生物量的測定

在發(fā)酵的不同時間點取出發(fā)酵液5 mL，3 000× g離心5 min，分別收集上清液和細胞沉淀。細胞沉淀在60 ℃烘干至恒重后稱重，生物量為每升發(fā)酵液中細胞的干重 (g/L)。上清液進行適當稀釋，用SBA-40C型生物傳感分析儀 (山東省科學(xué)院生物研究所) 測定乙醇和葡萄糖含量，單位為g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始酵母菌株的篩選

對實驗室保存的乙醇工業(yè)酵母菌株 CE1~CE8的耐熱性和發(fā)酵性能進行比較分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株在 30 ℃時的發(fā)酵性能沒有明顯差異，但菌株 CE6的熱耐受性較其他菌株要高，CE6的最高生長溫度是41 ℃ (圖1)，而其他菌株的最高生長溫度均為40 ℃。因此選擇菌株CE6進行進一步的耐熱性能改造。

2.2 化學(xué)誘變提高乙醇酵母的耐熱性

酵母菌株 CE6進行化學(xué)誘變后，菌液涂布于YEPD平板上，在42 ℃和43 ℃培養(yǎng)。通過耐熱性比較，篩選到最高能在43 ℃生長的突變株，分析比較這些突變株在30 ℃和40 ℃條件下的乙醇發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)這些突變株在 30 ℃時的發(fā)酵性能與 CE6相比沒有明顯差異，但在40 ℃發(fā)酵時，其中2個突變株的乙醇產(chǎn)量明顯優(yōu)于原始菌株 CE6，分別命名為T43-1和T43-2。

圖1 原始菌株CE6在不同溫度下的生長情況Fig. 1 Growth of original strain CE6 at different temperatures. Five colonies of the strain CE6 (from left to right) and serial dilution of 10?1 to 10?4 (from up to down) were spotted onto YEPD medium and cultivated at different temperature.

2.3 基于基因組 DNA誘變的遺傳重組技術(shù)提高乙醇酵母的耐熱性

提取突變株T43-1和T43-2的基因組DNA，等量混合后與化學(xué)誘變劑 DES溫育，然后分別電擊轉(zhuǎn)化突變株T43-1和T43-2，比較轉(zhuǎn)化菌株在不同溫度條件下的生長情況，篩選到能在 44 ℃正常生長、45 ℃時生長明顯受到抑制的重組菌株 (圖2)。比較這些菌株在不同溫度下的發(fā)酵性能 (30 ℃、40 ℃、42 ℃下發(fā)酵24 h)，發(fā)現(xiàn)在較高溫度條件下重組菌株T44-2的乙醇產(chǎn)量與原始菌株CE6相比有明顯提高。

圖2 重組菌株與原始菌株的耐熱性比較Fig. 2 Comparison of thermotolerance among recombinant strains and the original strain. 1: CE6; 2: T44-4; 3: T44-3; 4: T44-2; 5: T44-1. Serial dilution of 10?1 to 10?4 (from up to down) were spotted onto YEPD medium and cultivated at different temperatures.

重組菌株 T44-2和原始菌株 CE6在 48 ℃和52 ℃熱激處理0~2 h的過程中，T44-2的細胞存活率始終高于原始菌株CE6，其中48 ℃和52 ℃熱激處理1 h時，T44-2的細胞存活率分別是CE6的1.84倍和1.87倍 (圖3)，說明重組菌株T44-2比CE6具有更強的熱激耐受性。重組菌株T44-2在YEPD液體培養(yǎng)基中30 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)10次后，所檢測的單菌落均能在44 ℃正常生長，而且隨機檢測的10個單菌落的乙醇發(fā)酵性能指標沒有明顯差異，說明重組菌株T44-2是遺傳穩(wěn)定的。

2.4 不同溫度下乙醇發(fā)酵性能分析

圖3 重組菌株T44-2與原始菌株CE6在48 ℃和52 ℃的熱激存活率比較Fig. 3 Comparison of survival rate of the recombinant strain T44-2 and original strain CE6 under heat shock at 48 °C and 52 °C respectively.

對不同溫度下重組菌株T44-2和原始菌株CE6的乙醇發(fā)酵性能進行比較，發(fā)現(xiàn)在檢測的溫度范圍內(nèi)，重組菌株的產(chǎn)乙醇能力均高于原始菌株，而且溫度越高，這種優(yōu)勢越明顯 (圖4)。在30 ℃和37 ℃條件下發(fā)酵16 h后，200 g/L的葡萄糖被消耗完，重組菌株T44-2分別產(chǎn)生91.2 g/L和90.3 g/L乙醇，原始菌株CE6產(chǎn)乙醇量分別為85.2 g/L和85.1 g/L (圖4A、4B)。40 ℃發(fā)酵時，重組菌株T44-2和原始菌株CE6的發(fā)酵時間均比37 ℃發(fā)酵時延長了14 h，到30 h時乙醇產(chǎn)量達到最高，重組菌株T44-2基本上將200 g/L葡萄糖消耗完，產(chǎn)生了83.8 g/L乙醇，為37 ℃發(fā)酵時乙醇產(chǎn)量的92.8%，葡萄糖向乙醇轉(zhuǎn)化的效率為0.42 g/g；而原始菌株CE6的糖利用率只有79%，產(chǎn)生了64.7 g/L乙醇，為37 ℃發(fā)酵時乙醇產(chǎn)量的76%，葡萄糖向乙醇轉(zhuǎn)化的效率為0.41 g/g (圖4C)。兩株菌在42 ℃的發(fā)酵性能變化趨勢基本與40 ℃條件下一致，但生長和代謝活性均有所降低。在43 ℃和44 ℃條件下，原始菌株CE6的生長及代謝活性基本停止，葡萄糖利用率只有7.5%和7%，只有極少量乙醇產(chǎn)生；而重組菌株T44-2發(fā)酵36 h后糖利用率分別為 80.4%和 63.5%，分別產(chǎn)生了69.2 g/L 和52.6 g/L乙醇，分別是37 ℃發(fā)酵時乙醇產(chǎn)量的76.6%和58.3% (圖4E、4F)。上述結(jié)果表明重組菌株 T44-2不但對高溫具有良好的耐受性，其發(fā)酵活性也具有比較廣泛的溫度適應(yīng)性，在30 ℃~ 40 ℃范圍內(nèi)均具有良好的糖醇轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)量。

2.5 不同溫度下重組菌株的發(fā)酵動力學(xué)分析

重組菌株 T44-2發(fā)酵初始階段的菌體生長和乙醇生成較為緩慢，隨著時間的推移，增長速度明顯加快，經(jīng)過一段時間，菌體生長和乙醇生成的速度又趨于緩慢，以至停止。根據(jù)重組菌株細胞生長和乙醇生成的特性，選用Verhulst Pearl提出的Logistic方程，其表達式為：

利用Origin 7.5對重組菌株T44-2菌體生長曲線和乙醇生成曲線進行擬合。在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃的條件下，重組菌株T44-2的菌體生長和乙醇生成趨勢均與方程很好地擬合。

根據(jù)重組菌株T44-2的殘余葡萄糖的變化趨勢，選用Gauss方程，其表達式是

圖4 CE6和T44-2分別在30 ℃ (A)、37 ℃ (B)、40 ℃ (C)、42 ℃ (D)、43 ℃ (E) 和44 ℃ (F) 下的發(fā)酵性能比較Fig. 4 Comparison of fermentation performance of CE6 and T44-2 at different temperature. (A) 30 °C. (B) 37 °C. (C) 40 °C. (D) 42 °C. (E) 43 °C. (F) 44 °C. CE6: Glucose (■), Ethanol (●), Biomass (▲); T44-2: Glucose (□), Ethanol (○), Biomass (△).

利用Origin 7.5對重組菌株T44-2殘余葡萄糖曲線進行擬合，在30 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃的條件下，重組菌株T44-2的殘余葡萄糖趨勢均與方程很好地擬合。

由于不同溫度下的重組菌株T44-2的菌體生長、乙醇生成、殘余葡萄糖都能很好地與 Logistic方程和 Gauss方程進行擬合，猜測三者與溫度之間可能存在一定的線性關(guān)系，因此分別以重組菌株 T44-2的菌體生長、乙醇生成、殘余葡萄糖為因變量，以溫度和時間為雙自變量進行多重線性回歸分析，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，確定重組菌株 T44-2的菌體生長、乙醇生成、殘余葡萄糖分別與溫度和時間呈現(xiàn)出顯著的線性關(guān)系，可以建立動力學(xué)表達式 (表 1)。重組菌株 T44-2的菌體生長和乙醇生成隨著時間的增加而增大，溫度的升高而減??；殘余葡萄糖則隨著時間的增加而減小，隨著溫度的升高而增大。

表1 T44-2的發(fā)酵性能對發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的多重線性回歸分析Table 1 Result of multiple regression of fermentation efficiency of T44-2 for time and temperature

3 討論

酵母菌作為重要的乙醇發(fā)酵微生物，廣泛應(yīng)用于乙醇以及其他發(fā)酵工業(yè)。酵母菌在發(fā)酵過程中常常面臨高溫脅迫，嚴重地制約著發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)效率。因此篩選溫度耐受性強、發(fā)酵性能高的酵母菌株對于酵母菌在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的意義。酵母菌溫度耐受性的分子機制非常復(fù)雜，它涉及到細胞內(nèi)多個生理過程的改變，包括熱激蛋白的誘導(dǎo)表達[11]，細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性維持[12]，代謝過程的重構(gòu)等[13-14]。與這些生理過程相關(guān)的基因同時受到轉(zhuǎn)錄和翻譯后的蛋白質(zhì)修飾等多個水平的調(diào)控，不同基因產(chǎn)物之間彼此相互作用，形成了極其錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前為止，雖然確認了大量與酵母菌溫度耐受性相關(guān)的基因，但是對這些基因是如何產(chǎn)生和影響細胞溫度耐受性的認識還很有限。隨著基因工程技術(shù)的興起和對溫度耐受性相關(guān)基因的不斷認識，人們試圖通過調(diào)控一個或多個溫度耐受性相關(guān)基因的表達來定向改造酵母菌的耐熱性能，從而獲得耐高溫酵母菌株，但目前還沒有很成功的實例。因為酵母菌溫度耐受性分子機制的復(fù)雜性決定了單個或者少數(shù)幾個基因的改變難以達到提高酵母菌溫度耐受性的效果。

不同的帶有“黑箱”屬性的微生物育種技術(shù)被應(yīng)用于酵母菌溫度耐受性的改進中，Sridhar等通過UV誘變提高了釀酒酵母的溫度耐受性，該菌株在30 ℃和40 ℃發(fā)酵250 g/L葡萄糖，可以產(chǎn)生98 g/L和62 g/L乙醇[15]；Edgardo等通過自然篩選和適應(yīng)進化篩選到能夠在42 ℃生長的酵母菌株，該菌株在 40 ℃發(fā)酵葡萄糖，乙醇產(chǎn)量可以達到理論值的75%[3]。國內(nèi)的Jin等同樣利用UV誘變提高釀酒酵母的耐熱性，獲得的耐熱菌株在40 ℃發(fā)酵120 g/L葡萄糖，可以產(chǎn)生28 g/L乙醇[16]。上述研究雖然均獲得了能在40 ℃發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇的酵母菌，但在糖醇轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)量方面還難于滿足現(xiàn)實的需要。近年來基因組改組技術(shù)逐漸被應(yīng)用于酵母菌耐熱性的改造中，取得了比較好的研究效果[17]。本研究基于釀酒酵母遺傳轉(zhuǎn)化率高，能夠進行大片段基因組 DNA轉(zhuǎn)化[18]，技術(shù)方法比較成熟的特點，初步探索了一種新的促進酵母菌基因組 DNA變異的方法，并將其應(yīng)用于乙醇工業(yè)酵母的熱耐受性改造中，通過基于基因組DNA突變的遺傳重組方法篩選到一株溫度耐受性和乙醇發(fā)酵性能提高的重組菌株T44-2。重組菌株T44-2在30 ℃~40 ℃有良好的發(fā)酵性能，能夠耐受乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的溫度波動，而對發(fā)酵性能沒有明顯影響，因此重組菌株在實際應(yīng)用中可以極大減少加熱和冷卻成本，實現(xiàn)大宗發(fā)酵產(chǎn)品乙醇生產(chǎn)的低能耗和低污染，有望帶來明顯的經(jīng)濟效益。基于基因組DNA突變的遺傳重組育種方法，克服了基因工程同時調(diào)控基因數(shù)量有限的不足，它可以同時在多個位點上引起突變，同時上調(diào)和下調(diào)多個基因的表達，從而擴大和提高基因的突變頻率和范圍，為耐高溫酵母菌株篩選提供了更大的空間。在上述研究基礎(chǔ)上，將進一步優(yōu)化基于基因組DNA突變的遺傳重組方法，提高遺傳轉(zhuǎn)化和同源重組的有效性，并嘗試在酵母菌其他生理功能進化中的應(yīng)用。另外重組菌株為什么產(chǎn)生了對溫度的廣泛適應(yīng)性是我們非常關(guān)注的問題，目前我們正在利用基因芯片技術(shù)進行重組菌株和原始菌株的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。希望通過揭示重組菌株耐熱機制，為酵母菌，甚至其他工業(yè)微生物耐熱性能的理性設(shè)計和改造提供重要的解決策略。

REFERENCES

[1] Banat IM, Nigam P, Singh D, et al. Review: ethanol production at elevated temperatures and alcohol concentrations: part I-yeasts in general. World J Microbiol Biotechnol, 1998, 14(6): 809?821.

[2] Banat IM, Nigam P, Marchant R. Isolation of thermotolerant, fermentative yeasts growing at 52 °C and producing ethanol at 45 °C and 50 °C. World J Microbiol Biotechnol, 1992, 8(3): 259?263.

[3] Edgardo A, Carolina P, Manuel R, et al. Selection of thermotolerant yeast strains Saccharomyces cereviae for bioethanol production. Enzyme Microb Technol, 2008, 43(2): 120?123.

[4] Shimoda C, Itadani A, Sugino A, et al. Isolation of thermotolerant mutants by using proofreading-deficient DNA polymerase δ as an effective mutator in Saccharomyces cerevisiae. Genes Genet Syst, 2006, 81(6): 391?397.

[5] Sakanaka K, Yan W, Kishida M, et al. Breeding a fermentative yeast at high temperature using protoplast fusion. J Ferment Bioeng, 1996, 81(2): 104?108.

[6] Hiraishi H, Mochizuki M, Takagi H. Enhancement of stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae by overexpression of ubiquitin ligase rsp5 and ubiquitinconjugating enzymes. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(11): 2762?2765.

[7] Zhang BR, Liu SF, Wang YH, et al. Induced effect by dicthvl sulphate and N-Methyl-N'-Nitro-N-nitrosoguanidine in Saccharomyces. Hereditas, 1985, 7(5): 12?13.張博潤, 劉書鋒, 王永紅, 等. 兩種化學(xué)誘變劑對酵母菌的誘變效應(yīng). 遺傳, 1985, 7(5): 12?13.

[8] Adams A, Gottschling DE, Kaiser CA, et al. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997.

[9] Becker DM, Guarente L. High-efficiency transformation of yeast by electroporation. Methods Enzymol, 1991, 194: 182?187.

[10] He X, Huai W, Tie C, et al. Breeding of high ergosterolproducing yeast strains. J Ind Microbiol Biotechnol, 2000, 25(1): 39?44.

[11] Estruch F. Stress-controlled transcription factors, stressinduced genes and stress tolerance in budding yeast. FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(4): 469?486.

[12] Toh-e A, Yasunaga S, Nisogi H, et al. Three yeast genes, PIR1, PIR2 and PIR3, containing internal tandem repeats, are related to each other, and PIR1 and PIR2 are required for tolerance to heat shock. Yeast, 1993, 9(5): 481?494.

[13] Hahn JS, Hu ZZ, Thiele DJ, et al. Genome-wide analysis of the biology of stress responses through heat shock transcription factor. Mol Cell Biol, 2004, 24(12): 5249?5256.

[14] Yamamoto N, Maeda Y, Ikeda A, et al. Regulation of thermotolerance by stress-induced transcription factors in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic Cell, 2008, 7(5): 783?790.

[15] Sridhar M, Sree NK, Rao LV. Effect of UV radiation on thermotolerance, ethanol tolerance and osmotolerance of Saccharomyces cerevisiae VS1 and VS3 strains. Bioresour Technol, 2002, 83(3): 199?202.

[16] Jin CT, Han N, Wu X, et al. Isolation and characterization of a highly thermotolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae. Ann Microbiol, 2005, 55(1): 57?61.

[17] Shi DJ, Wang CL, Wang KM. Genome shuffling to improve thermotolerance, ethanol tolerance and ethanol productivity of Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(1): 139?147.

[18] Kouprina N, Larionov V. Exploiting the yeast Saccharomyces cerevisiae for the study of the organization and evolution of complex genomes. FEMS Microbiol Rev, 2003, 27(5): 629?649.