重疊延伸PCR克隆三孢布拉霉carRA基因及其功能活性檢測系統(tǒng)的構(gòu)建

湯暉，石楠，于淼，劉龍，劉靜，賈穎，牛宏彥，張利平

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用實驗室，保定 071002

番茄紅素 (Lycopene) 具有極強(qiáng)的清除自由基[1]、誘導(dǎo)細(xì)胞分化[2]、增加免疫力[3]、減少 DNA損傷等功能，對防癌抗癌[4]、預(yù)防心血管疾病、提高免疫功能和延緩衰老均有一定的療效[5]，因此，具有極大的生產(chǎn)和消費潛力。番茄紅素的生產(chǎn)開發(fā)項目已成為國際上功能性食品和新藥研究的熱點，已被納入我國的“十一五國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃”。

在全球范圍內(nèi)，三孢布拉氏霉菌 Blakeslea trispora是實現(xiàn)番茄紅素工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌株。它是一種產(chǎn) β-胡蘿卜素的高產(chǎn)菌，番茄紅素是其代謝的中間產(chǎn)物，工業(yè)生產(chǎn)上通過添加阻斷劑來抑制 β-胡蘿卜素生物合成途徑中番茄紅素環(huán)化酶的活性，從而積累番茄紅素。番茄紅素環(huán)化酶由carRA基因編碼產(chǎn)生，是否通過基因工程的手段敲除carRA基因，菌體就會積累番茄紅素？研究表明：CarRA為雙功能蛋白，既有環(huán)化酶活性又有八氫番茄紅素合成酶的功能活性，而八氫番茄紅素合成酶是番茄紅素合成途徑中上游的關(guān)鍵酶[6]。因此，carRA基因的完全敲除必然導(dǎo)致番茄紅素的合成失敗。

本研究將構(gòu)建體外檢測番茄紅素環(huán)化酶和八氫番茄紅素合成酶功能活性的篩選模型，為通過定點突變探測 CarRA蛋白番茄紅素環(huán)化酶活性位點、而不影響八氫番茄紅素合成酶功能活性提供檢測系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

所用質(zhì)粒及其主要遺傳特性如表 1所示。大腸桿菌菌株 DH5α、BL21，三孢布拉氏霉菌菌株ATCC14272及質(zhì)粒 pET28a為本實驗室保存，pMD18-T載體購自 TaKaRa公司，質(zhì)粒 pAC-LYC由美國馬里蘭大學(xué)Elisabeth Gantt教授饋贈。

1.1.2 主要試劑

pfu DNA聚合酶、Ex-Taq 聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、dNTPs、凝膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.1.3 PCR擴(kuò)增引物及序列

引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成 (表2)。

表1 本實驗所用質(zhì)粒及特性Table 1 Plasmids used in this work, and their relevant characteristics

表2 PCR擴(kuò)增引物及序列Table 2 Primer and primer sequence

1.2 方法

1.2.1 重疊延伸PCR法克隆carRA基因的cDNA序列

以番茄紅素環(huán)化酶基因 DNA序列 (GenBank Accession No. AY884174.1) 設(shè)計引物，擴(kuò)增上游(1~405 bp) 和下游 (476~1 897 bp) 序列，并分別于相應(yīng)引物 5′端添加 EcoRⅠ酶切位點。SDS-CTAB法提取三孢布拉霉基因組DNA為模板，分別以1(up)/1(down) 和 2(up)/2(down) 為引物對，pfu DNA聚合酶擴(kuò)增carRA基因的2個外顯子片段。擴(kuò)增反應(yīng)條件均為：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，61 ℃ 10 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)。分別回收上輪PCR的2個產(chǎn)物，等摩爾比例混合適當(dāng)稀釋后作為模板，以 1 (up)/2(down) 為引物對，進(jìn)行第 2輪PCR：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。PCR初步鑒定后，送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用Blastn程序比對。

1.2.2 大腸桿菌表達(dá)載體pET28a-carRA的構(gòu)建和重組子的篩選

提取質(zhì)粒pMD18-T-carRA，EcoRⅠ完全酶切，回收小片段連接至表達(dá)載體pET28a，重組表達(dá)載體pET28a-carRA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，卡那霉素抗性基因篩選并PCR初步鑒定后測序驗證。

1.2.3 番茄紅素環(huán)化酶活性的檢測

提取質(zhì)粒 pAC-LYC，轉(zhuǎn)化含有表達(dá)載體pET28a-carRA的 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，Kan和Cm雙抗篩選轉(zhuǎn)化子。pAC-LYC含有細(xì)菌來源的類胡蘿卜素代謝途徑中的 3個基因 crtE/crtI/crtB，在大腸桿菌中能積累番茄紅素，環(huán)化酶可以催化番茄紅素生成類胡蘿卜素，菌體將由粉紅色變?yōu)辄S色，因此可以利用顏色的改變初步檢測和鑒定環(huán)化酶活性。陽性克隆子于含Kan和Cm (終濃度50 mg/L) 的LB 培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6時加入終濃度為 1 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.8時，室溫振蕩培養(yǎng)12~24 h，離心收集菌體觀察菌體顏色。以空載體 pET28a轉(zhuǎn)化含質(zhì)粒pAC-LYC的BL21(DE3) 菌株作為陰性對照。

1.2.4 八氫番茄紅素合成酶活性體外檢測載體的構(gòu)建

以載體 pAC-LYC為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建。pAC-LYC中有2個NcoⅠ酶切位點，分別位于crtB基因和cm抗性基因內(nèi)部。根據(jù)Tn9轉(zhuǎn)座子上的氯霉素抗性基因序列 (GenBank Accession No. V00622.1) 設(shè)計引物，擴(kuò)增cm基因被NcoⅠ切下的約500 bp的片段cm’，用來補(bǔ)全 cm基因提供質(zhì)粒 Cm抗性。以引物P1和 P2、質(zhì)粒 pAC-LYC為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物NcoⅠ完全酶切后與 pAC-LYC NcoⅠ完全酶切后的大片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 BL21(DE3)，氯霉素抗性平板 (終濃度50 mg/L) 篩選。挑取單克隆菌落，PCR初步鑒定后測序驗證，重組質(zhì)粒命名為pAC-LYC△(crtB)。

為進(jìn)一步驗證構(gòu)建的pAC-LYC△(crtB) 載體的可靠性，進(jìn)行crtB基因互補(bǔ)試驗。依據(jù)質(zhì)粒pAC-LYC中的crtB基因序列設(shè)計引物，并添加EcoRⅠ酶切位點，以引物 crtB1和 crtB2進(jìn)行擴(kuò)增，回收 930 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，將正向連入的T+crtB質(zhì)粒進(jìn)行 SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切，連接到質(zhì)粒pET28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，卡那抗性平板 (終濃度50 mg/L) 培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。通過PCR鑒定和測序驗證插入的序列及方向是否正確，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pET28a-crtB。將crtB基因缺失的質(zhì)粒 pAC-LYC△(crtB) 與重組質(zhì)粒pET28a-crtB共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用Kan和Cm雙抗平板 (終濃度50 mg/L) 篩選，陽性克隆子的顏色鑒別實驗同環(huán)化酶活性檢測，同時分別以含有質(zhì)粒 pAC-LYC△(crtB) 和 pET28a-crtB的BL21(DE3) 菌株為陰性對照。載體構(gòu)建和基因互補(bǔ)實驗的技術(shù)路線如圖1所示。

圖1 八氫番茄紅素合成酶活性體外檢測載體的構(gòu)建和基因互補(bǔ)實驗的技術(shù)路線Fig. 1 Construction of phytoene synthase activity detection vector and gene complementary.

1.2.5 八氫番茄紅素合成酶活性的檢測

提取質(zhì)粒pAC-LYC△(crtB)，轉(zhuǎn)化含有表達(dá)載體pET28a-carRA的大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，Kan和 Cm雙抗篩選轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步的顏色互補(bǔ)實驗同環(huán)化酶活性檢測。

1.2.6 番茄紅素含量測定

將恒重后的菌體研碎，稱取0.5 g，加入少量丙酮∶石油醚 (1∶1) 混合液，在研缽中研磨萃取至提取液完全無色，將萃取液過濾定容至10 mL容量瓶，高效液相色譜法 (HPLC) 測定。色譜儀為watersl525高效液相色譜儀、UV-VLS Detee-tor2487雙通道紫外檢測器；分離柱為Lichrospher-5-Cu， 5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相為甲醇∶乙腈∶二氯甲烷 (7∶7∶2，V/V/V)；檢測波長472 nm，柱溫35 ℃，流速l mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 carRA基因的克隆及測序

經(jīng)過2次PCR擴(kuò)增，得到了三孢布拉霉番茄紅素環(huán)化酶基因的2個外顯子片段。從圖2可看出泳道1大小為400 bp左右，和第一外顯子大小一致；泳道2大小為1 400 bp左右，和第二外顯子大小一致，由此可初步確定擴(kuò)增到了兩個外顯子片段。經(jīng)重疊延伸PCR后，泳道3、4是拼接產(chǎn)物的檢測，大小為1 800 bp左右處有擴(kuò)增條帶，和番茄紅素環(huán)化酶cDNA大小基本一致，可以初步確定克隆出番茄紅素環(huán)化酶cDNA片段。

將拼接產(chǎn)物膠回收后連接至pMD18-T載體，進(jìn)行測序，結(jié)果表明克隆的基因和該序列完全一致，同源性達(dá) 100%。表明克隆得到的三孢布拉霉番茄紅素環(huán)化酶cDNA序列完全正確。

圖2 重疊延伸PCR擴(kuò)增carRA基因Fig. 2 PCR amplification of two exons of carRA gene. 1: the first exon of carRA gene; 2: the second exon of carRA gene; 3,4: splicing results of two exons; M: DNA marker.

2.2 表達(dá)載體pET28a-carRA的鑒定

將番茄紅素環(huán)化酶基因的cDNA序列導(dǎo)入原核表達(dá)載體 pET28a，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-carRA，經(jīng) PCR擴(kuò)增初步檢測 (圖 3) 和測序驗證，表明質(zhì)粒中carRA序列為正向插入多克隆位點，表明原核表達(dá)載體pET28a-carRA構(gòu)建成功。

2.3 八氫番茄紅素合成酶活性檢測載體pAC-LYC△(crtB) 的鑒定

擴(kuò)增cm基因中NcoⅠ酶切位點下游的序列，與質(zhì)粒 pAC-LYC NcoⅠ完全酶切后的大片段相連，通過 Cm抗性篩選及 PCR鑒定 (圖 4)，表明pAC-LYC△(crtB) 構(gòu)建正確。

圖3 表達(dá)載體pET28a-carRA的PCR鑒定Fig. 3 Identification of pET28a-carRA by PCR. 1: PCR products of pET28a-carRA; M: DNA marker.

圖4 cm’序列的PCR擴(kuò)增Fig. 4 PCR products of cm’. 1,2: PCR products of pAC-LYC; 3,4: PCR products of pAC-LYC△(crtB); M: 250 bp ladder.

通過基因互補(bǔ)實驗進(jìn)一步驗證 pAC-LYC△(crtB) 載體中CrtB酶活性喪失，而crtE和crtI還保留相應(yīng)功能。自質(zhì)粒pAC-LYC中擴(kuò)增得到crtB基因的編碼區(qū) (圖5)，正向插入pET28a的多克隆位點，PCR反應(yīng)結(jié)果 (圖5) 及測序結(jié)果表明 crtB基因的表達(dá)載體 pET28a-crtB構(gòu)建正確。pET28a-crtB和 pAC-LYC△(crtB) 共轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)12~24 h后轉(zhuǎn)入室溫暗處，1 d后菌體開始變?yōu)殚偌t色，2 d后顏色進(jìn)一步加深。而陰性對照始終為大腸桿菌的本色。

圖5 ctrB 基因的PCR擴(kuò)增Fig. 5 PCR products of crtB. 1,2: PCR products of pAC-LYC; 3,4: PCR products of pET28a-crtB. M: 250 bp ladder.

圖6 HPLC檢測質(zhì)粒pAC-LYC在大腸桿菌BL21中的表達(dá)Fig. 6 HPLC analysis of pAC-LYC expressed in E. coli BL21.

2.4 三孢布拉霉carRA基因番茄紅素環(huán)化酶和八氫番茄紅素合成酶活性的驗證

將表達(dá)載體 pET28a-carRA轉(zhuǎn)化到帶有質(zhì)粒pAC-LYC的大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，菌體顏色由粉紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。通過這個酶活試驗，表明carRA基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)⒐こ叹蟹e累的番茄紅素 (粉紅色) 轉(zhuǎn)化成 β-胡蘿卜素 (黃色)，初步證明了CarRA蛋白具有番茄紅素環(huán)化酶的功能與活性。

將表達(dá)載體 pET28a-carRA轉(zhuǎn)化到帶有質(zhì)粒pAC-LYC△(crtB) 的大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，菌體顏色由大腸桿菌本色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。通過這個顏色互補(bǔ)試驗，表明carRA基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠合成番茄紅素并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成 β-胡蘿卜素 (黃色)，初步證明了CarRA蛋白亦具有八氫番茄紅素合成酶功能與活性。

通過HPLC分析可定性和定量地確證篩選模型中 CarRA蛋白的功能活性。如圖 6所示，crtE/crtI/crtB基因簇正確的順序作用將使菌體積累番茄紅素；當(dāng)環(huán)化酶行使功能時菌體積累β-胡蘿卜素 (圖7)。

圖7 HPLC檢測質(zhì)粒pAC-LYC和pET28a-carRA，或pAC-LYC△ (crtB) 和 pET28a-carRA在大腸桿菌BL21中的共表達(dá)Fig. 7 HPLC analysis of pAC-LYC and pET28a-carRA or pAC-LYC△(crtB) and pET28a-carRA co-expressed in E. coli BL21.

3 討論

在多數(shù)情況下擴(kuò)增真核生物的目的編碼基因都采取RT-PCR的策略，而提取RNA的過程較煩瑣且需要時刻防止 RNA酶的污染。相比較而言，DNA的提取及其 PCR擴(kuò)增則容易得多。采用重疊延伸PCR的方式，能快速獲得目的基因，不僅克服了RT-PCR中必須依賴mRNA的問題，而且有很高的效率[8]。

從carRA基因的擴(kuò)增可以看出，合理設(shè)計的引物可保證第1個外顯子和第2個外顯子的準(zhǔn)確性，使得融合位點正確拼接；相連引物間的重疊區(qū)域達(dá)到了26個堿基，亦避免富含AT的序列，在片段合成過程中，防止了錯配發(fā)生。

重疊延伸PCR包括2個階段，第1個階段分別擴(kuò)增出2個外顯子，第2個階段以上個階段的2個產(chǎn)物為模板擴(kuò)增出完整的 DNA序列，2個產(chǎn)物的大小不同，很容易導(dǎo)致模板量有較大的差異，在擴(kuò)增時候需要考慮引物和模板的比例關(guān)系。一般需要使模板的摩爾數(shù)相同，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專@樣才能有效保證擴(kuò)增到目標(biāo)片段。

質(zhì)粒 pAC-LYC自構(gòu)建以來，對多種來源的環(huán)化酶如藍(lán)細(xì)菌[7]、植物[9]、藻類[10]等，通過菌體顏色變化，即可簡單直觀地對蛋白的環(huán)化酶活性進(jìn)行鑒定。本研究首次對三孢布拉霉來源的環(huán)化酶功能活性采用顏色互補(bǔ)實驗進(jìn)行初步篩查，同時亦改造了 pAC-LYC質(zhì)粒，使其僅具有細(xì)菌來源的類胡蘿卜素代謝途徑中的 2個基因 crtE/crtI，即質(zhì)粒pAC-LYC△(crtB)。當(dāng)重組蛋白具有八氫番茄紅素合成酶活性時，在大腸桿菌中能積累番茄紅素，菌體呈現(xiàn)粉紅色，據(jù)此可鑒定蛋白的八氫番茄紅素合成酶功能活性。此外，pAC-LYC△(crtB) 也可同時鑒定八氫番茄紅素合成酶和番茄紅素環(huán)化酶的功能活性，即菌體呈現(xiàn)黃色。

三孢布拉霉是目前發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素的主要菌種，但需要添加阻斷劑抑制番茄紅素環(huán)化酶活性從而實現(xiàn)番茄紅素的積累。阻斷劑的添加不僅增加了生產(chǎn)工藝流程，亦會對后續(xù)的提取質(zhì)量產(chǎn)生影響，因此通過基因工程的手段獲得番茄紅素環(huán)化酶活性缺失的工程菌是符合生產(chǎn)需求的。

卷枝毛霉Mucor circinelloides中的CarRP蛋白亦為雙功能蛋白，與三孢布拉霉CarRA蛋白為同功酶，Velayos等[11]的研究表明，CarRP蛋白 N端某些氨基酸的突變會積累番茄紅素，說明番茄紅素環(huán)化酶活性喪失而保留有八氫番茄紅素合成酶活性。同樣的現(xiàn)象在紅法夫酵母 Xanthophyllomyces dendrorhous中亦有發(fā)現(xiàn)[12]。番茄紅素環(huán)化酶由carRA基因編碼，但CarRA蛋白為雙功能蛋白，又具有八氫番茄紅素合成酶活性，只有通過定點突變才可能缺失CarRA蛋白的番茄紅素環(huán)化酶活性，而不影響八氫番茄紅素合成酶的正常功能。

本研究確立的酶活檢測模型將為此提供簡便、可靠的篩選方法：利用質(zhì)粒pAC-LYC檢測番茄紅素環(huán)化酶活性是否改變；發(fā)生改變的再用質(zhì)粒pAC-LYC△(crtB) 檢測八氫番茄紅素合成酶活性的變化，最后通過HPLC進(jìn)一步確證。

REFERENCES

[1] Hadley CW, Clinton SK, Schwartz SJ. The consumption of processed tomato products enhances plasma lycopene concentration in association with a reduced lipoprotein sensitivity to oxidative damage. J Nutr, 2003, 133(3): 727?732.

[2] Yilmaz S, Atessahin A, Sahna E, et al. Protective effect of lycopene on adriamycin induced cardiotoxicity and nephrotoxicity. Toxicology, 2006, 218(2/3): 164?171.

[3] Blum A, Monir M, Wirsansky I, et al. The beneficial effects of tomatoes. Eur Intem Med, 2005, 16(6): 402?444.

[4] Mein JR, Lian F, Wang XD. Biological activity of lycopene metabolites: implications for cancer prevention. Nutr Rev, 2008, 66(12): 667?83.

[5] Omoni A, Aluko RE. The anti-carcinogenic and antiatherogenic effects of lycopene: a review. Trends Food Sci Technol, 2005, 16(8): 344?350.

[6] Rodríguez-Sáiz M, Paz B, de la Fuente JL, et al. Blakeslea trispora genes for carotene biosynthesis. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(9): 5589?5594.

[7] Francis XC Jr, Sun Z, Chamovitz D. Molecular structure and enzymatic function of lycopene cyclase from the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC7942. Plant Cell, 1994, 6(8): 1107?1121.

[8] Heckman KL, Pease LR. Gene splicing and mutangenesis by PCR-driven overlap extension. Nature, 2007, 2(4): 924?932.

[9] Devitt LC, Fanning K, Dietzgen RG, et al. Isolation and functional characterization of a lycopene β-cyclase gene that controls fruit colour of papaya (Carica papaya L.). J Exp Bot, 2010, 61(1): 33?39.

[10] Li T, Shi CL, Gan ZB, et al. Cloning and analysis of the gene encoding lycopene epsilon cyclase in Chlorella protothecoides CS-41. Acta Microbiol Sin, 2009, 49(9): 1180?1189.李婷, 施春雷, 淦志兵, 等. 原殼小球藻番茄紅素 ε環(huán)化酶基因的克隆和分析. 微生物學(xué)報, 2009, 49(9): 1180?1189.

[11] Velayos A, Eslava AP, Iturriaga EA. A bifunctional enzyme with lycopene cyclase and phytoene synthase activities is encoded by the carRP gene of Mucor circinelloides. Eur J Biochem, 2000, 267(17): 5509?5519.

[12] Verdoes JC, Krubasik P, Sandmann G, et al. Isolation and functional characterisation of a novel type of carotenoid biosynthetic gene from Xanthophyllomyces dendrorhous. Mol Gen Genet, 1999, 262(3): 453?461.