評價(jià)納米顆粒細(xì)胞毒性的方法

李曉東,徐 紅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科,吉林長春130021)

自20世紀(jì)80年代末以來,納米科技迅猛發(fā)展,納米材料在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[1]。但是,人們對于納米材料對環(huán)境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少[2]。為此,納米毒理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生[3]。納米毒理學(xué)是專門研究納米顆?；虿牧隙拘缘膶W(xué)科,運(yùn)用一系列方法來分析納米材料在體內(nèi)和體外所產(chǎn)生的影響[4]。一般利用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行納米材料的細(xì)胞毒性評價(jià),它是一類在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境,檢測醫(yī)療器械和生物材料在接觸機(jī)體組織后所產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)[5]。納米顆粒與細(xì)胞的相互作用研究剛剛開始[6]。細(xì)胞成活力評價(jià)包括增殖、壞死、凋亡等方面。本文就納米毒理學(xué)中常用的細(xì)胞毒性檢測方法作一簡要綜述,以供大家對納米材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)時(shí)作為參考。

1 增殖檢測

1.1 MTT法

MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創(chuàng),其基本原理是活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苡谒乃{(lán)紫色結(jié)晶體甲瓚(formazan)顆粒,后者的生成量與活細(xì)胞數(shù)目和/或細(xì)胞活性呈正相關(guān)[7]。用二甲亞砜溶解所生成的甲瓚,然后通過酶標(biāo)儀可以測定570 nm波長附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快,則吸光度越高;細(xì)胞毒性越大,則吸光度越低。MTT法被廣泛用于評價(jià)多種納米材料的體外細(xì)胞毒性[8,9]。與其他毒性分析方法相比,MTT法有很多優(yōu)點(diǎn),例如:簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏,無放射性污染,不需預(yù)標(biāo)記靶細(xì)胞[10]。缺點(diǎn):需分別加入MTT及DMSO;測試后細(xì)胞不能繼續(xù)培養(yǎng);生成的甲瓚不易充分溶解。

1.2 WST-1法

WST-1是由日本同仁化學(xué)研究所開發(fā)的第一個(gè)水溶性四唑鹽試劑,可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲瓚(formazan)顆粒,生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。WST-1是MTT的一種升級替代產(chǎn)品,和MTT或其它MTT類似產(chǎn)品如XTT等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。第一,WST-1產(chǎn)生的甲瓚顆粒是水溶性的,不需要特定的溶解液來溶解。第二,WST-1更加穩(wěn)定。第三,WST-1線性范圍更寬,靈敏度更高。近年又出現(xiàn)了一種CCK-8試劑,其原理與WST-1法相同,也具有WST-1法的優(yōu)點(diǎn)。侯春梅等[11]研究證明,CCK-8法顯色時(shí)間短、操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好,而且檢測后的細(xì)胞可重復(fù)利用,具有一定的實(shí)用性,可以替代MTT法并廣泛應(yīng)用。

1.3 [3H]胸腺嘧啶摻入法

測定摻入新合成的DNA中的[3H]胸腺嘧啶的量,是一種敏感度非常高的檢測細(xì)胞增殖的方法。原理是將放射性同位素3H代替H,根據(jù)細(xì)胞核酸代謝率不同,3H摻入的量也就不同,再用閃爍儀器定量檢測不同樣品中摻入的3H量,來反應(yīng)細(xì)胞的增殖狀態(tài)。如果[3H]胸腺嘧啶摻入量減少,說明細(xì)胞增殖受到抑制。但是這種方法經(jīng)常不被采用,因?yàn)橘M(fèi)用較高,而且需要接觸3H同位素,對體外的細(xì)胞有損傷[12,13]。

1.4 Alamar Blue法

新一代熒光染料Alamar Blue為活細(xì)胞代謝指示劑,易溶于水。該法的原理為氧化型Alamar Blue可被活細(xì)胞中的線粒體酶還原,還原后染料發(fā)生顏色和熒光改變,其深淺與活細(xì)胞數(shù)量成正比,可用分光光度計(jì)或熒光檢測儀檢測[14]。該方法已被用于檢測:多種化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞毒性試驗(yàn);淋巴細(xì)胞、貼壁或不貼壁的人及動物細(xì)胞株、細(xì)菌及真菌的增殖;細(xì)胞凋亡的量化以及細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。楊陽等[15]研究發(fā)現(xiàn) Alamar Blue法是一種簡便、敏感、安全、經(jīng)濟(jì)的方法,可用于體外測定細(xì)胞增殖及化療或免疫制劑的細(xì)胞毒作用。

2 壞死檢測

細(xì)胞壞死是因病理而產(chǎn)生的被動死亡,往往會導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂。在體外納米毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞膜的完整性是一個(gè)可以用來評價(jià)細(xì)胞活力的指標(biāo)[16,17]。常用的評價(jià)細(xì)胞膜完整性的方法包括:(1)檢測細(xì)胞對某些離體活體染料的吸收,例如,臺盼藍(lán)(Trypan Blue)[18],中性紅(Neutral Red)[19],碘化丙啶(propidium iodide)[20]等。(2)檢測細(xì)胞死亡后滲漏到細(xì)胞培養(yǎng)基中的活性酶的量,主要是乳酸脫氫酶LDH分析法[21]。

2.1 染色法

臺盼藍(lán)和碘化丙啶是帶電荷的分子,不能進(jìn)入活的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂時(shí),臺盼藍(lán)就會進(jìn)入細(xì)胞中,并且在605 nm波長處有較強(qiáng)的吸收。碘化丙啶進(jìn)入細(xì)胞以后,會嵌入DNA和雙鏈RNA中,用617 nm波長激發(fā)會發(fā)出熒光。中性紅易溶于水和醇,水溶液呈紅色,醇溶液為黃色。在生理?xiàng)l件的pH值時(shí),中性紅是不帶電荷的,此時(shí),中性紅既能進(jìn)入活細(xì)胞,也能進(jìn)入死細(xì)胞。在活細(xì)胞中,溶酶體的酸度較高(pH≈4.8),中性紅會被質(zhì)子化并聚集于溶酶體中,在540 nm波長處有較強(qiáng)的吸收。因此,中性紅可使活細(xì)胞染成紅色,而死細(xì)胞不變色,這點(diǎn)和臺盼藍(lán)相反。以上這些檢測技術(shù)可重復(fù)性好,并且應(yīng)用流式細(xì)胞儀可提高檢測速度。

2.2 乳酸脫氫酶LDH法

乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶,定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。一般情況下,LDH不能透過細(xì)胞膜,當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)可釋放到細(xì)胞外,此時(shí)培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比。乳酸脫氫酶能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中呈棕紅色,可通過比色求出酶活力。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的LDH的活性,可判斷細(xì)胞受損的程度。優(yōu)點(diǎn):測定迅速,避免了同位素的使用,并且能夠進(jìn)行定量分析。缺點(diǎn):(1)乳酸脫氫酶是大分子,只有靶細(xì)胞膜完全被破壞后才能釋放出來,不能較早的反映細(xì)胞的存活狀況。(2)影響因素較多,例如,培養(yǎng)基、測定環(huán)境的溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間等[22]。

3 凋亡檢測

細(xì)胞凋亡(apoptosis),又稱程序性細(xì)胞死亡,是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下,遵循自身的程序,自己結(jié)束生命的過程[23]。細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞死亡形式。在2.2中介紹的方法只能檢測壞死的細(xì)胞或者處于凋亡晚期的細(xì)胞,只有結(jié)合凋亡檢測技術(shù)才能完整地揭示出細(xì)胞死亡的整個(gè)過程。凋亡檢測技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于納米毒理學(xué)研究中,包括:細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,膜聯(lián)蛋白V(annexin-V)法[24],DNA階梯法(DNA laddering)[25],彗星實(shí)驗(yàn)(the Comet assay)[26],TUNEL法[27,28]等。

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

普通光學(xué)顯微鏡下可觀察到貼壁生長的凋亡細(xì)胞皺縮、圓化,細(xì)胞的體積變小,但細(xì)胞膜完整,常可見胞膜發(fā)泡的現(xiàn)象,細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。在熒光顯微鏡下,吖啶橙染色后,活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光,胞質(zhì)呈橘紅色熒光,而凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)。透射電鏡下可觀察到細(xì)胞凋亡時(shí)特征性的超微結(jié)構(gòu)改變,如凋亡細(xì)胞體積變小,細(xì)胞質(zhì)濃縮,表面微絨毛消失,核染色質(zhì)凝聚、邊緣化,呈新月形。

3.2 膜聯(lián)蛋白V法

膜聯(lián)蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)是一種相對分子質(zhì)量為35-36 kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,能與磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)高親和力特異性結(jié)合。PS正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。因此,應(yīng)用膜聯(lián)蛋白Ⅴ法可鑒定早期細(xì)胞凋亡。將膜聯(lián)蛋白Ⅴ用熒光素(FITC,PE,EGFP)標(biāo)記,以標(biāo)記了的膜聯(lián)蛋白Ⅴ作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3.3 DNA階梯法

細(xì)胞凋亡或壞死時(shí),核內(nèi)DNA都會發(fā)生斷裂。區(qū)別在于,凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)有規(guī)律地發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)長度為180-200 bp的DNA片段,電泳時(shí)呈現(xiàn)階梯狀條帶;而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)無規(guī)律性,產(chǎn)生的雜亂片段在電泳時(shí)呈現(xiàn)模糊的連續(xù)性條帶。利用這一特征可以將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞相區(qū)別。優(yōu)點(diǎn):簡便易行,費(fèi)用低廉。缺點(diǎn):易受機(jī)械損傷、化學(xué)物質(zhì)刺激等其他因素影響,而且只能定性,不能定量。

3.4 彗星實(shí)驗(yàn)

“彗星”電泳技術(shù),即單細(xì)胞凝膠電泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE),可用于觀察單個(gè)細(xì)胞DNA的損傷。此法是將少量分散懸浮的單個(gè)細(xì)胞與1%低溫瓊脂糖液混合后在冰凍玻片上制成瓊脂板,細(xì)胞經(jīng)過水解和堿化處理后,在較高pH值的環(huán)境下進(jìn)行電泳。當(dāng)DNA有斷裂損傷時(shí),細(xì)胞核中帶有陰性電荷的DNA斷片就從核心向陽極方向移動,形成一個(gè)類似“彗星”的圖象,根據(jù)“彗星”的頭部和尾部的大小和比率,從而確定細(xì)胞DNA損傷的程度。馬愛國等[29]研究證明,“彗星”電泳技術(shù)是較敏感的DNA斷裂損傷分析技術(shù),在檢測體內(nèi)和體外細(xì)胞DNA的輕微損傷方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.5 TUNEL法

TUNEL法,即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend-labeling,TUNEL),其原理是:細(xì)胞凋亡時(shí),染色質(zhì)DNA斷裂產(chǎn)生大量的粘性3′-OH端,在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下,將脫氧核糖核苷酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到 DNA的3′-OH端,可通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。該法將分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合,能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡時(shí)典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞,因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

4 結(jié)語

納米技術(shù)是柄雙刃劍,納米材料可能給人們的健康帶來潛在危害。目前,納米材料的毒理學(xué)研究還很不完善,人們對納米材料毒性的認(rèn)識也很貧乏。納米毒理學(xué)研究與納米技術(shù)發(fā)展是相互促進(jìn)的,必須一起協(xié)調(diào)發(fā)展,才能更好地完成科學(xué)技術(shù)造福于人類的目的和任務(wù)[30]。對納米材料毒性的研究,會促使人們重新設(shè)計(jì)、制造毒性較少的納米顆粒,從而最終使納米科技成為安全造福人類的新技術(shù)。

[1]周國強(qiáng),陳春英,李玉峰,等.納米材料生物效應(yīng)研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008,35(9):998.

[2]田志環(huán).納米材料的毒理學(xué)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,35(18):3608.

[3]Lewinski N,Colvin V,Drezek R.Cytotoxicity of Nanoparticles[J].Small,2008,4(1):26.

[4]Marquis BJ,Love SA,Braun KL,et al.Analytical methods to assess nanoparticle toxicity.Analyst,2009,134(3):425-439.

[5]周 輝,粱 瑜.多種生物材料細(xì)胞生物相容性及其安全性的系統(tǒng)評價(jià)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2009,13(38):7559.

[6]陳丹丹,母瑞紅,奚廷斐.評價(jià)納米生物材料安全性的研究進(jìn)展[J].生物醫(yī)學(xué)工程與臨床,2007,11(1)66.

[7]MOSMANN T.Colorimetric assay cellulargrowth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,65(1):55.

[8]Sayes CM,Reed KL,Warheit DB.Assessing toxicity of fine and nanoparticles:comparing in vitro measurements to in vivo pulmonary toxicity profiles[J].Toxicol Sci,2007,97(1):163.

[9]Wagner AJ,Bleckmann CA,Murdock RC,et al.Cellular interaction of different forms of aluminum nanoparticles in rat alveolar macrophages[J].J Phys Chem B,2007,111(25):7353.

[10]Marshall NJ,Goodwin CJ,Holt SJ.A critical assessment of the use of microculture tetrazolium assays to measure cell growth and function[J].Growth Regul,1995,5(2):69.

[11]侯春梅,李新穎,葉偉亮,等.MTT法和CCK-8法檢測懸浮細(xì)胞增殖的比較[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2009,33(4):400.

[12]Hussain SM,Frazier JM.Cellular toxicity of hydrazine in primary rat hepatocytes[J].Toxicol Sci,2002,69(2):424.

[13]Orlov SN,Pchejetski DV,Sarkissian SD,et al.[3H]-thymidine labelling of DNA triggers apoptosis potentiated by E1A-adenoviral protein[J].Apoptosis,2003,8(2):199.

[14]范能全,彭 蘭.Alamar Blue法測定細(xì)胞毒性[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22(4):474.

[15]楊 陽,劉寶瑞,錢曉萍.Alamar Blue法用于體外培養(yǎng)細(xì)胞活性檢測的方法研究[J].MODERN ONCOLOGY,2006,14(1):6.

[16]Kostarelos K,Lacerda L,Pastorin G,et al.Cellular uptake of functionalized carbon nanotubes is independent of functional group and cell type[J].Nat Nanotechnol,2007,2(2):108.

[17]VeversWF,Jha AN.Genotoxic and cytotoxic potential of titanium dioxide(TiO2)nanoparticles on fish cells in vitro[J].Ecotoxicology,2008,17(5):410.

[18]Zhang C,W?ngler B,Morgenstern B,et al.Silica-and alkoxysilane-coated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles:a promising tool to label cells for magnetic resonance imaging[J].Langmuir,2007,23(3):1427.

[19]Monteiro-Riviere NA,Nemanich RJ,Inman AO,et al.Multi-walled carbon nanotube interactions withhuman epidermal keratinocytes[J].Toxicol Lett,2005,155(3):377.

[20]Jin Y,Kannan S,Wu M,et al.Toxicity of luminescent silica nanoparticles to living cells[J].Chem Res Toxicol,2007,20(8):1126.

[21]Lee KJ,Nallathamby PD,Browning LM,et al.In vivo imaging of transport and biocompatibility of single silver nanoparticles in early development of zebrafish embryos[J].ACS Nano,2007,1(2):133.

[22]王甫厚,陳紹先,郭彩云,等.LDH釋放法測NK細(xì)胞毒的方法學(xué)研究[J].中國免疫學(xué)雜志,1990,6(2):115.

[23]王嘉寧,郭 寧.細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)與方法[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2005,19(6):466.

[24]Pan Y,Neuss S,Leifert A,et al.Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles[J].Small,2007,3(11):1941.

[25]Cui D,Tian F,Ozkan CS,et al.Effect of single wall carbon nanotubes on human HEK293 cells[J].Toxicol Lett,2005,155(1):73.

[26]Omidkhoda A,Mozdarani H,Movasaghpoor A,et al.Study of apoptosis in labeled mesenchymal stem cells with superparamagnetic iron oxide using neutral comet assay[J].Toxicol In Vitro,2007,21(6):1191.

[27]Bhol KC,Schechter PJ.Topical nanocrystalline silver cream suppresses inflammatory cytokines and induces apoptosis of inflammatory cells in a murine model of allergic contact dermatitis[J].Br J Dermatol,2005,152(6):1235.

[28]Mo Y,Lim LY.Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles:potentiation of anticancer activity by surface conjugation with wheat germ agglutinin[J].J Control Release,2005,108(2):244.

[29]馬愛國,韓秀霞,劉四朝.兩種DNA斷裂損傷檢測方法敏感性的比較[J].遺傳,1997,19(1)32.

[30]應(yīng)賢平,仲偉鑒.納米二氧化鈦顆粒毒理學(xué)進(jìn)展[J].毒理學(xué)雜志,2006,20(5):334.