高遷移率族蛋白B1檢測及其臨床應(yīng)用

李 蕾,楊 嵐,陳國千*

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,江蘇無錫214023;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院檢驗科)

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)為細胞核中一種典型的非組蛋白,于20世紀70年代在胸腺中與染色體DNA一起純化而被發(fā)現(xiàn),因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移性而得名。HMGB1曾稱為HMG-1、amphoterin,早期集中研究其核內(nèi)功能,包括參與核小體的構(gòu)建和穩(wěn)定、調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、參與DNA的重組修復(fù)和復(fù)制等。1999年,Wang等[1]發(fā)現(xiàn)HMGB1可以釋放到胞外并介導(dǎo)炎癥反應(yīng),為一種重要的晚期炎癥介質(zhì),隨后胞外HMGB1的致炎作用引起國內(nèi)外廣泛重視,諸多研究表明胞外HMGB1在急慢性炎癥性疾病如膿毒癥、關(guān)節(jié)炎、肺炎、急性胰腺炎等的發(fā)病過程中起著重要作用。現(xiàn)就HMGB1的檢測方法和臨床應(yīng)用進展作一綜述。

1 胞外HMGB1的致炎作用

HMGB1廣泛分布于淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等組織細胞中,主要存在于胞核,分子量約30 kDa。研究[2,3]顯示巨噬細胞、單核細胞、垂體細胞、上皮細胞、肝細胞等受內(nèi)毒素脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、生物活性脂等誘導(dǎo)后,HMGB1可主動分泌到細胞外。HMGB1因缺乏引導(dǎo)肽結(jié)構(gòu)而不能以高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑分泌,可能通過非經(jīng)典途徑(如分泌溶酶體)釋放。HMGB1胞外釋放涉及胞核內(nèi)HMGB1轉(zhuǎn)移到胞漿然后胞外的過程[4]。壞死或受損細胞也可被動釋放HMGB1,但凋亡細胞由于HMGB1緊密結(jié)合于染色質(zhì)而不能釋放HMGB1。胞外HMGB1與相應(yīng)胞膜受體如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)、Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體 4(TLR4)等結(jié)合,通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[2]。

近年諸多研究[2]證實,胞外HMGB1為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細胞因子。體外實驗表明,重組HMGB1激活巨噬細胞、外周血單核細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞等表達和釋放TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、巨噬細胞炎癥蛋白 -1α(MIP-1α)、MIP-1β、細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管細胞粘附分子(VCAM-1)等炎癥介質(zhì)或致炎細胞因子,啟動和維持炎癥免疫反應(yīng)或使炎癥惡化。最近Qin等[5]報道 HMGB1通過MAPK p38磷酸化明顯加強內(nèi)毒素的致炎作用。體內(nèi)實驗也顯示HMGB1的致炎作用,給予小鼠半數(shù)致死量(LD 50)內(nèi)毒素后8小時,血清HMGB1濃度升高,16-32小時后血清HMGB1水平達高峰,注射抗HMGB1抗體能有效抑制內(nèi)毒素血癥或膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)并降低死亡率[1];小鼠氣管內(nèi)給予HMGB1可誘發(fā)急性肺損傷,病變部位發(fā)生中性粒細胞聚集、水腫以及有早期致炎細胞因子如 IL-1β、TNF、MIP-2的產(chǎn)生,且呈劑量依賴效應(yīng)[2];腦室內(nèi)注射HMGB1后增加腦組織TNF、IL-6的表達,引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng);小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射HMGB1后可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。

2 HMGB1檢測方法

目前,胞外HMGB1檢測有蛋白免疫印跡(Western Blot)[1]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[6,7]和凝膠阻滯分析(EMSA)[8]三種方法。蛋白免疫印跡分析是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進行檢測,操作繁瑣費時,靈敏度低,準確性差,屬于定性或半定量檢測。

近年,Yamada等[6]使用抗HMGB1單克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA法檢測HMGB1,靈敏度、準確性、特異性明顯提高,與HMGB2無交叉反應(yīng),且操作方便,可成批檢測。Yamada等[6]建立的ELISA方法以辣根過氧化物酶為標記酶,而底物有四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、PS-1和PS-atto,前者為比色分析,后二者為發(fā)光分析;以PS-1為底物的 ELISA方法,有效檢測范圍為2-100 ng/ml,批間、批內(nèi)變異系數(shù)分別為＜10%和＜5%,回收率為92-111%;而以四甲基聯(lián)苯胺、PS-atto為底物的ELISA方法,靈敏度提高,檢測線性范圍分別為1-100 ng/ml和0.3-160 ng/ml。Urbonaviciute等[7]建立以生物素-親和素系統(tǒng)為標記物和對硝基苯磷酸酯為底物的夾心ELISA法,檢測線性范圍達0.4-300 ng/ml,但Urbonaviciute等認為血清或血漿中存在抗HMGB1抗體和其它HMGB1結(jié)合蛋白,影響HMGB1的準確定量,應(yīng)引起重視。為了進一步縮短檢測時間,國內(nèi)王維等使用抗HMGB1單克隆抗體以辣根過氧化物酶為標記酶(底物:鄰苯二胺)建立了直接競爭ELISA法,測定范圍為1-320 ng/ml,回收率為 97%-106%,變異系數(shù)為2.6%-7.3%。目前市場已有HMGB1的商品化ELISA試劑盒供應(yīng),日本Shino-Test公司供應(yīng)的以四甲基聯(lián)苯胺為底物的ELISA試劑盒,其批間、批內(nèi)變異系數(shù)分別為＜8%和＜5%,血清或血漿標本回收率為80-120%,HMGB1最低檢測濃度為＜1 ng/ml。

最近,Gaillard等[8]利用HMGB1蛋白與DNA片段探針呈高親和力結(jié)合的特性,以同位素作探針標記,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,與HMGB1結(jié)合的DNA探針在凝膠中泳動速度慢,表現(xiàn)為相對滯后,以此原理建立凝膠阻滯分析(EMSA)。此方法對于成分復(fù)雜的標本如血清檢測靈敏度達1 ng/ml,而對于成分不復(fù)雜的標本如細胞培養(yǎng)上清液則靈敏度更高,且不易受血清中的干擾蛋白影響。

由于HMGB1在血液、體液、細胞培養(yǎng)液、灌洗液等標本中一般含量較低,采用上述方法有時難以檢出或準確定量,因此HMGB1測定方法有待進一步改進,以提高檢測的靈敏度和準確性。另外,因細胞溶解可釋放HMGB1,HMGB1檢測的血液標本應(yīng)立即分離血清或血漿。

3 HMGB1檢測的臨床應(yīng)用

鑒于HMGB1在諸多疾病發(fā)病過程中的重要作用和HMGB1測定方法的改進,臨床標本尤其血清中HMGB1檢測的意義和應(yīng)用日益受到重視。

諸多研究[1,9]顯示膿毒癥患者血清HMGB1水平明顯升高,并發(fā)現(xiàn)血清HMGB1水平與血清C-反應(yīng)蛋白、降鈣素原、脂多糖結(jié)合蛋白、白細胞介素-6水平及白細胞計數(shù)等炎癥指標間具有一定的相關(guān)性,但血清HMGB1水平與膿毒癥嚴重程度及其預(yù)后的關(guān)系觀點尚未一致。Zoelen等[10]報道腹膜炎所致膿毒癥患者的腹水HMGB1水平為血漿HMGB1水平的10倍以上,肺炎所致膿毒癥患者的支氣管肺泡灌洗液HMGB1水平明顯高于正常對照組,提示HMGB1釋放可能主要發(fā)生在感染部位。

活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血漿HMGB1水平顯著高于健康對照組,并與紅細胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān),但風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清或血漿中HMGB1水平未見升高[11]。

重癥急性胰腺炎患者血清HMGB1水平明顯升高,血清HMGB1水平與該病嚴重程度有關(guān),并與乳酸脫氫酶、C-反應(yīng)蛋白及總膽紅素指標等呈顯著性正相關(guān)。Lindstrom等[12]報道重癥急性胰腺炎患者血清HMGB1水平與患者是否發(fā)展出現(xiàn)器官衰竭無關(guān)聯(lián)。

社區(qū)獲得性肺炎患者血清HMGB1水平升高,但與并發(fā)膿毒癥無關(guān)。并發(fā)流感病毒感染的嚴重細菌性肺炎患者血漿HMGB1水平明顯高于單純細菌性肺炎患者,且前者血漿HMGB1水平與白細胞計數(shù)呈較好的相關(guān)性[13]。

慢性乙型肝炎患者血清HMGB1水平與病情的嚴重程度密切相關(guān),HMGB1可能在慢性重型乙型肝炎患者肝衰竭的發(fā)生中起重要作用。HIV-1感染者血漿HMGB1水平明顯升高,血漿HMGB1水平與性別、年齡、病毒量、CD4或 CD8 T-細胞數(shù)等無顯著相關(guān)性[14]。

變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(亦稱Churg-Strauss綜合征)患者血清HMGB1水平明顯高于哮喘患者和健康者,與血清可溶性IL-2受體、可溶性血栓調(diào)節(jié)素、嗜酸性細胞陽離子蛋白等水平呈顯著性正相關(guān),患者經(jīng)激素治療后血清HMGB1水平下降[15]。Yamada等[6]結(jié)果顯示,隨后發(fā)生心搏停止或急性心肌梗塞致死的急性冠脈綜合癥患者血清HMGB1水平明顯高于未發(fā)生心臟意外者,如果以血清HMGB1水平0.6 ng/mL為界值,血清HMGB1水平用于預(yù)測急性冠脈綜合癥患者一個月內(nèi)發(fā)生心臟意外的特異性和靈敏度分別為87%和71%。穩(wěn)定型心絞痛和不穩(wěn)定型心絞痛患者血清HMGB1水平與冠狀動脈狹窄嚴重程度有關(guān)[16]。

血清HMGB1水平與組織缺血有關(guān),失血性休克患者在休克后24小時內(nèi)血清HMGB1水平升高,72小時達到峰值,96小時開始下降,而患者血壓恢復(fù)和臨床癥狀改善后,血清HMGB1水平也恢復(fù)正常。急性冠脈綜合征和大腦缺血患者血清HMGB1水平明顯升高[17]。彌散性血管內(nèi)凝血使血漿HMGB1水平顯著升高。缺血致血清HMGB1水平升高的機理還不清楚,可能是缺血后的TNF反應(yīng)性升高激活免疫細胞釋放HMGB1,或由損傷細胞或死亡細胞釋放HMGB1。

機械外傷致血清HMGB1水平顯著升高,外傷后1小時血清HMGB1水平升高30倍,2-6小時達峰值,并維持高值至136小時以上[18];外科術(shù)后患者血清HMGB1水平升高,并與術(shù)后并發(fā)癥有關(guān),術(shù)后血清HMGB1水平測定有助于術(shù)后并發(fā)癥的監(jiān)測[19];燒傷后患者血漿HMGB1水平明顯升高。

腦膜炎患者腦脊液HMGB1水平升高,而細菌性腦膜炎患者腦脊液HMGB1水平為非細菌性腦膜炎患者的4倍,并與白細胞計數(shù)呈較好的正相關(guān);蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液HMGB1水平也明顯升高,并與腦脊液中IL-6、IL-8及TNF-α水平呈顯著性正相關(guān)[20]。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液HMGB1水平升高,并明顯高于骨關(guān)節(jié)炎患者。我們最近研究顯示,胸水HMGB1水平檢測對于胸腔漏出液與滲出液以及滲出液性質(zhì)的鑒別診斷具有較好的臨床意義,若結(jié)合胸水HMGB1/血清HMGB1比值分析,能進一步提高該指標的應(yīng)用價值(待發(fā)表)。

胞外HMGB1作為一種重要的炎癥介質(zhì)已引起廣泛重視,隨著HMGB1定量檢測方法如ELISA的建立,使之HMGB1檢測的臨床應(yīng)用具有可行性。近年國內(nèi)外很重視胞外HMGB1的臨床研究,以了解胞外HMGB1在臨床疾病發(fā)病機理中的作用,探討胞外HMGB1測定在疾病風(fēng)險預(yù)測、臨床疾病診斷、預(yù)后判斷中的意義,以及開辟臨床疾病的HMGB1靶向治療新途徑。

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