惡性腫瘤患者循環(huán)DNA的研究進(jìn)展

倪培民,孫 然,王 雷,劉 鐵,叢憲玲*

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院組織標(biāo)本庫)

*通訊作者

目前,對(duì)于惡性腫瘤,缺乏一種行之有效的早期診斷手段。絕大多數(shù)的惡性腫瘤明確診斷時(shí)已經(jīng)是中晚期,經(jīng)治療后患者五年生存率極低[1],并且預(yù)后極易復(fù)發(fā)。所以建立一種方便、微創(chuàng)、靈敏、特異的惡性腫瘤早期診斷手段勢(shì)在必行,循環(huán)DNA極易獲得,在惡性腫瘤發(fā)生的早期其含量和基因的異常改變就可以被檢測(cè)到[2],有望發(fā)展成為惡性腫瘤早期診斷的有效手段。

1 循環(huán)DNA的來源

循環(huán)DNA是一種存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中的細(xì)胞外DNA。腫瘤患者外周血中存在的循環(huán)DNA,含量明顯高出健康人水平,并且這些循環(huán)DNA具有腫瘤特征性。定量或定性分析這些循環(huán)DNA對(duì)腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后的評(píng)價(jià)都具有重要意義。

早在1947年Mandcl和Metals就發(fā)現(xiàn)了循環(huán)核酸,30年后Leon[3]等人的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液循環(huán)中循環(huán)DNA的水平顯著高于正常人。健康人外周血游離DNA大多來源于血細(xì)胞,而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細(xì)胞。通過近年的研究,人們推測(cè)腫瘤患者循環(huán)血中存在著的大量DNA可能來源于以下一些途徑[4]:(1)循環(huán)血或微轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞溶解;(2)腫瘤細(xì)胞的壞死或凋亡;(3)腫瘤細(xì)胞不斷釋放DNA進(jìn)入血液循環(huán);(4)腫瘤侵襲致周圍細(xì)胞、組織變性而釋放DNA入血;(5)淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用。由此可見,腫瘤患者循環(huán)DNA的形成是多種途徑共同作用的結(jié)果。Domirguez等[5]分別檢測(cè)同一組患者的血細(xì)胞、腫瘤組織和血漿中DNA變異,27例膀胱癌患者中17例檢出血漿DNA與腫瘤組織DNA發(fā)生相同的改變。Szymanska等[6]檢測(cè)的29例肝細(xì)胞癌患者血漿與腫瘤DNA變異一致性達(dá)88.5%,這些都說明了外周血循環(huán)DNA主要來自腫瘤細(xì)胞。

2 循環(huán)DNA的定量檢測(cè)

有很多文獻(xiàn)都有對(duì)DNA定量的研究,但是對(duì)于DNA的定量檢測(cè)一直沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),以前是加入一些顯色劑,使之發(fā)生顯色反應(yīng),然后根據(jù)顏色改變的程度與濃度的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,檢測(cè)其濃度,這種方法的特異性和敏感性非常低,限制了它們的應(yīng)用。其它的分析方法,如血清凝集素抑制、補(bǔ)體結(jié)合等,在特異性上可能有所提高,但在敏感性上沒有進(jìn)一步的改善。近年來,隨著DNA-RNA雜交技術(shù)、放射免疫分析法、對(duì)流免疫電泳技術(shù)的發(fā)展,納克級(jí)(ng)的DNA可以被檢測(cè)[7]?，F(xiàn)在,實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Real-Time PCR)可以檢測(cè)皮克(pg)級(jí)的DNA。當(dāng)然也有一些改進(jìn)技術(shù)或聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)可以更加精確地測(cè)定循環(huán)DNA的含量。

趙文君[8]等對(duì)44例食管癌患者及100例健康對(duì)照的外周血,采用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血漿DNA含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管癌患者血漿DNA含量顯著高于健康對(duì)照(P＜0.001)。Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲ-Ⅳ期患者血漿DNA含量分別為37.0 ng/ml、53.0 ng/ml和66.3 ng/ml。 Ⅲ-Ⅳ期明顯高于Ⅱa-Ⅱb期(P=0.003)。Ⅱa和Ⅱb期的血漿 DNA含量顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.001)。高、中分化組和低分化組的血漿DNA含量分別為 32.3 ng/ml、52.9 ng/ml和 65.0 ng/ml,低分化組顯著高于高、中分化組(P=0.010)。潘世揚(yáng)等[9]采用多重實(shí)時(shí)PCR技術(shù)對(duì)78例肺癌患者的血漿APC基因甲基化進(jìn)行定量分析,其中的19例肺癌患者血漿中APC基因啟動(dòng)子甲基化陽性,APC甲基化濃度為1.67×102-6.78×103拷貝/mL,中位濃度為1.60×103拷貝/mL。38例組織陰性的肺癌患者、31例肺部良性疾病患者和23例健康者的血漿APC基因啟動(dòng)子甲基化均為陰性。

這表明在腫瘤患者中存在循環(huán)DNA水平的升高和甲基化異?，F(xiàn)象,循環(huán)DNA可能成為腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)志,可能與腫瘤的臨床分期和腫瘤分化程度存在相關(guān)性;實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)由于其高精度已成為現(xiàn)在檢測(cè)循環(huán)DNA的主流技術(shù)。

3 循環(huán)DNA的定性分析

循環(huán)DNA和人類基因組DNA在核苷酸及堿基組成上是基本一致的,至少有47%的循環(huán)DNA堿基序列存在于人類基因組DNA中。已有很多研究表明循環(huán)DNA的基因改變與腫瘤組織DNA有較高的一致性[10-11]。目前循環(huán)DNA的定性分析包括:基因突變、甲基化異常、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、雜合性缺失檢測(cè)等。

3.1 循環(huán)DNA的基因突變

K-ras基因是p21蛋白質(zhì)的編碼基因,是人類腫瘤中最常見活化的原癌基因之一,在多種腫瘤中存在點(diǎn)突變,突變熱點(diǎn)主要有三個(gè),即密碼子12、13、和61,尤其是12,這種異常尤以胰腺癌、結(jié)腸癌等發(fā)生率較高[12-13]。MuLcahy等[14]應(yīng)用RFLP-PCR法檢測(cè)了21例胰腺癌患者的循環(huán)DNA,結(jié)果有17例患者的循環(huán)DNA中有K-ras基因突變,其中有4例循環(huán)DNA中有K-ras基因突變的患者最初診斷為胰腺炎,在此后的5-14個(gè)月中相繼被診斷為胰腺癌。

腫瘤抑制基因p53是迄今為止在人類癌癥中最常突變的基因,且突變范圍廣,其功能缺失可導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定并誘發(fā)腫瘤,也可阻斷主要的凋亡途徑。研究顯示在結(jié)直腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和頭頸部癌患者血漿/血清DNA中檢測(cè)到p53的點(diǎn)突變[15-16]。

3.2 循環(huán)DNA甲基化異常

DNA的甲基化是指生物體在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA mothyltransferase,D MT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上去的過程。DNA甲基化是人類重要的表觀遺傳學(xué)修飾,它可以調(diào)控基因的表達(dá)[19],由于甲基化的異常變化早于腫瘤的惡性增生[20],它的檢測(cè)對(duì)腫瘤的早期診斷有重要意義。AnQ等[21]報(bào)道在所研究的105例非小細(xì)胞肺癌患者中,73.3%的血樣中和79.3%的腫瘤樣中,p16基因發(fā)生甲基化異常改變。Fujiwara K等[22]檢測(cè)了91例肺癌患者血漿中的p16,MGMT、DAPK、RASSF1A和RAR-β基因,其中45例患者存在甲基化異?，F(xiàn)象。Liu JY[23]等也檢測(cè)了137例肺癌患者血漿中的p16基因,結(jié)果是105例患者存在甲基化現(xiàn)象,說明p16基因與肺癌的相關(guān)性比較高,對(duì)于肺癌的早期診斷有重要的意義。對(duì)于不同的惡性腫瘤,存在高甲基化現(xiàn)象的相關(guān)基因也不同,研究顯示前列腺癌與 GSTP1基因[24-25]、腎癌與 VHL基因[26-27]、結(jié)直腸與MLH1基因[28]、食管癌與APC基因[29]相關(guān)性很高。建立各種惡性腫瘤的相關(guān)基因甲基化譜式對(duì)于腫瘤的早期診斷、預(yù)后判斷及治療都具有重要意義。

循環(huán)DNA的甲基化現(xiàn)象與腫瘤細(xì)胞DNA的甲基化現(xiàn)象呈現(xiàn)高度的一致性,并且甲基化異常現(xiàn)象先于腫瘤蛋白標(biāo)志物的出現(xiàn),對(duì)于惡性腫瘤的早期檢測(cè)更有優(yōu)勢(shì),有望成為評(píng)價(jià)腫瘤狀態(tài)的特異性標(biāo)志物。

3.3 微衛(wèi)星改變

微衛(wèi)星(microsatellite)序列,又稱短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat,STR)序列,屬于第二代DNA遺傳標(biāo)記,是由2-6個(gè)堿基對(duì)作為核心單位,串聯(lián)重復(fù)排列而成的一類DNA序列,它在人類基因組中分布廣泛且呈高度多態(tài)性。腫瘤中微衛(wèi)星改變主要有兩種:微衛(wèi)星雜合性的缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability,MSI)。

3.3.1雜合性缺失(LOH)

LOH常表現(xiàn)為一條等位基因的突變及另一條等位基因的缺失,通過缺失使得雜合體中原先隱性突變的抑癌基因被顯示出來,可以同時(shí)伴有基因兩側(cè)標(biāo)志的缺失,使抑癌基因周圍的區(qū)域成為純合子或半合子,LOH可導(dǎo)致抑癌基因的失活,從而參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。Allan等[17]對(duì)60例未確診但懷疑有肺癌的病例進(jìn)行研究,檢測(cè)了47份支氣管黏膜組織DNA和40份血漿DNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),47份支氣管黏膜組織中有13份檢測(cè)出了LOH,而這13例患者都被證實(shí)患有肺癌,而40份血漿中有13份被檢測(cè)出了LOH,這13例患者中有12例被證實(shí)患有肺癌,在血漿中檢測(cè)出LOH的患者中63%也可在相應(yīng)的組織內(nèi)檢測(cè)出LOH,而在腫瘤組織內(nèi)檢測(cè)出LOH的患者中有86%也可在血漿中檢測(cè)出。說明了檢測(cè)血漿中DNA的LOH可以作為早期診斷肺癌的一種手段。

3.3.2微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)

MSI指在腫瘤發(fā)展的早期由于錯(cuò)配修復(fù)缺陷導(dǎo)致的DNA復(fù)制錯(cuò)誤從而改變了微衛(wèi)星序列的重復(fù)數(shù)目,出現(xiàn)滑動(dòng)的插入及缺失,表現(xiàn)為基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列次數(shù)的增加或減少,導(dǎo)致微衛(wèi)星序列不能正常地發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用,進(jìn)而使細(xì)胞增殖及分化異常,直接促進(jìn)了惡性腫瘤形成和發(fā)展。Nunes等[18]用8個(gè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定標(biāo)志研究91例頭頸部鱗癌患者的循環(huán)DNA,其中早期者17例,進(jìn)展期者74例。結(jié)果有58例腫瘤組織發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變,并在17例(29%)患者循環(huán)DNA中檢測(cè)到類似的改變,說明MSI的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的中早期檢測(cè)具有一定的意義。

4 循環(huán)DNA的臨床意義

健康人的外周血中只含有極少量的循環(huán)DNA,在炎癥及腫瘤患者的外周血中循環(huán)DNA的含量明顯增加。如果將檢測(cè)外周血DNA水平應(yīng)用于診斷惡性腫瘤,則必須先排除各類急慢性炎癥和自身免疫性疾病。Leon[3]等很早就提出了監(jiān)測(cè)外周血游離DNA水平在觀察療效、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)方面的作用,測(cè)定了173例不同惡性腫瘤患者治療前外周血游離DNA的水平并觀察其在放療后的變化,結(jié)果表明,有轉(zhuǎn)移的患者平均 DNA濃度為209±39 μ g/L,而無轉(zhuǎn)移患者平均為 100±30 μ g/L,有顯著差異。循環(huán)DNA水平與腫瘤患者的生存密切相關(guān),手術(shù)前檢測(cè)循環(huán)DNA水平可以初步判斷腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后,有助于對(duì)病人治療方案的選擇。循環(huán)DNA分子學(xué)改變對(duì)腫瘤的早期診斷及預(yù)后評(píng)估都有重要意義。

也有研究對(duì)循環(huán)DNA檢測(cè)的意義提出不同的觀點(diǎn)[30]。首先,循環(huán)DNA的起源沒有一個(gè)明確的說法,認(rèn)定循環(huán)DNA的確切來源還存在爭(zhēng)議;再者,循環(huán)DNA水平是在一個(gè)寬量程、無序的范圍內(nèi)波動(dòng),檢測(cè)的時(shí)效性是關(guān)鍵的因素;最后,由于對(duì)血樣標(biāo)本的處理不同、對(duì)照人群選擇的差異和定量分析技術(shù)的差異,大量的同類研究之間存在顯著性差異。

5 小結(jié)與展望

根據(jù)生物學(xué)的中心法則,遺傳物質(zhì)的改變是蛋白質(zhì)構(gòu)象和表達(dá)的改變的基礎(chǔ)。因此,我們可以想象,每種腫瘤標(biāo)志物的形成,其前提都存在著特定腫瘤DNA分子的缺失或突變。綜上所述,檢測(cè)外周血游離DNA對(duì)腫瘤的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)價(jià)等都具有重要意義。筆者認(rèn)為,盡管循環(huán)DNA的應(yīng)用還有一些問題存在,但循環(huán)DNA的獲得只需要患者的血清或血漿,較容易,可以發(fā)展成為一種方便、特異、無創(chuàng)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段,用于腫瘤的早期診斷和預(yù)防。另外,利用國(guó)內(nèi)外建立的組織標(biāo)本庫等生物學(xué)資源,開展大規(guī)模的流行病學(xué)的監(jiān)控,系統(tǒng)的收集癌癥患者的血清標(biāo)本,建立循環(huán)DNA定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化程式以及各類型腫瘤定性分析的相關(guān)譜式,應(yīng)作為未來研究的重點(diǎn)。唯有如此,循環(huán)DNA檢測(cè)才能作為一種標(biāo)準(zhǔn)化的方法應(yīng)用于臨床。在未來的幾年里,相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,循環(huán)DNA檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化,循環(huán)DNA在腫瘤的早期診斷和檢測(cè)方面會(huì)得到廣泛的應(yīng)用。

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