戊型肝炎與疫苗

邵惠訓

戊型肝炎是一種由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的急性胃腸道傳播的傳染病。戊型肝炎的癥狀與甲型肝炎類似，但病死率更高，癥狀更重，對孕婦、胎兒、老年人和慢性肝病患者的危害更大。孕婦病死率高達15%～25%[1]，幸存的孕婦極易發(fā)生流產、早產和死胎。早在 1955年12月，印度新德里由于自來水水源受患者或動物糞便污染，引起 29 000 例黃疸型肝炎流行[2]。隨后在亞洲廣袤地區(qū)發(fā)生了多次戊型肝炎流行，印度、中國、緬甸和尼泊爾為高流行區(qū)。1982年前蘇聯學者 Balayan 等將非甲非乙型肝炎患者糞便標本，讓患過甲型肝炎的志愿者口服。36 d 后，出現典型的肝炎癥狀。用免疫電鏡技術從患者糞便標本檢出圓球形病毒樣顆粒，并從患者恢復期血清檢出病毒抗體。1986 – 1988年在我國新疆南部地區(qū)發(fā)生了世界上最大的一次戊型肝炎暴發(fā)性流行，共發(fā)生病人 12 萬例，死亡 707 例，其中孕婦 414 例，造成了重大經濟損失，影響了社會安定。

戊型肝炎是人畜禽共患的疾病。黑猩猩、恒河猴、獼猴、狨猴、鼠猴、梟猴、短尾猴、食蟹猴和非洲綠猴等靈長類動物和豬、牛、羊、鹿、貓、狗、雞、鴨和大白鼠等均對 HEV易感。從動物分離的 HEV 與從人體分離的 HEV 在基因序列上高度一致。其中恒河猴是最理想的實驗動物模型。在很多地區(qū)，豬是主要的儲存宿主和傳染源，戊型肝炎嚴重危害豬和禽類養(yǎng)殖事業(yè)。越來越多的動物被發(fā)現對 HEV 易感，但細胞培養(yǎng)病毒目前尚未成功。病毒經人體和實驗動物胃腸道黏膜進入血流，到達肝臟進行復制。病毒隨血流擴散的同時，進入膽囊，最后從糞便排出體外。HEV 進入人體后，引起機體體液免疫和細胞免疫應答。產生的血清抗體有IgA、IgM 和 IgG。戊型肝炎發(fā)病后 1 個月，血清中有較高滴度的 IgA 抗體。發(fā)病后 5 個月，從血清中消失。IgM抗體在血清中出現較早。病毒感染后 1 周，在血清中出現，3 個月后消失。IgG 抗體在發(fā)病后 9 d 就能從血清檢出，滴度高，在血清中能持續(xù) 10 多年[3-4]。

1 HEV 的基因結構、編碼的蛋白與機體免疫應答

HEV 屬肝炎病毒科（hepeviridae）肝炎病毒屬（hepevirus），是單股正鏈 RNA 病毒，無囊膜，表面有纖突。20 面體對稱，病毒顆粒直徑為27～34 nm。病毒有實心和空心兩種，有 8 種基因型。1 型主要在亞洲和非洲人群中流行，以緬甸株為代表；2 型在墨西哥和非洲尼日利亞和納米比亞等國流行，以墨西哥株為代表；3 型能感染人和豬，分布廣泛，包括發(fā)達國家，如美國和日本多見[5]，3 型再分為10 個亞型（3a～3j）；4 型在亞洲的人群和豬群中流行[6]，在我國豬群中流行的病毒主要是 4 型，也有少數3 型，4 型再分為7 個亞型（4a～4g），4 型肝炎比 3 型嚴重；5 型感染鳥類；5～8 型流行于歐洲。在我國以 1 型和 4 型為主。從不同地區(qū)分離到的病毒，存在明顯基因差異，而同一地區(qū)來源的 HEV 的基因序列相對穩(wěn)定[7]。HEV只有一個血清型?；蚪M長 7.3 kb，由一個 25 nt 的 5′ 端非編碼區(qū)（UTR）、三個開放讀碼框架（ORF1、ORF2 和ORF3）和一個 65～74 nt 的末端為多聚腺苷酸（polyA）的3′UTR 組成。病毒基因組由 5′UTR 到 3′UTR 依次為5′UTR-ORF1-ORF3-ORF2-3′UTR 和 poly A 尾。ORF1 編碼非結構蛋白，包括甲基轉移酶、半胱氨酸蛋白酶、RNA 解旋酶和 RNA 聚合酶。ORF2 編碼 660 個氨基酸的糖基化結構蛋白。ORF3 與 ORF2 有 331 nt 重疊，編碼 123 個氨基酸殘基的磷蛋白，能與細胞骨架蛋白和病毒衣殼蛋白結合，可能參與并調節(jié)細胞信號傳達[8]。HEV 的結構蛋白主要由 ORF2 基因編碼，含蓋了主要抗原表位和主要抗原決定簇，帶有明顯信號肽序列。用 ORF2 基因表達的重組抗原免疫實驗動物，能成功保護機體免受 HEV 的攻擊[9]。ORF2衣殼蛋白高度保守，免疫原性強，其產生的抗體具有中和性保護作用，在機體內維持時間很長，而且是引起細胞免疫應答的主要抗原。ORF3 蛋白能刺激機體產生抗體，但此抗體在體內維持時間很短。ORF1 蛋白免疫原性很弱，又不是病毒的結構成分，其抗體不具有保護作用。介導細胞免疫應答的抗原表位存在于 ORF2 蛋白，而非 ORF3 蛋白。人體感染 HEV 后的免疫反應主要由 ORF2 蛋白引起，體液免疫和細胞免疫同時存在。肝細胞損傷與免疫反應密切相關。

2 HEV 感染實驗室檢測技術

2.1 免疫電鏡技術（immune electron microscopy，IEM）

用常規(guī) IEM 檢測患者或實驗動物的糞便和膽汁中的HEV，用標記的抗-HEV 抗體可檢測肝細胞中的 HEAg。IEM 需要配置電鏡等特殊設備和培訓相關技術人員，患者排出病毒時間較短，病毒在外環(huán)境下又不穩(wěn)定。IEM 準確性雖高，但靈敏度很低，限制了此法推廣使用。

2.2 免疫熒光技術（indirect immunofluorescent assay，IFA）

從實驗感染 HEV 的獼猴血清或單克隆抗體提取 IgG，經熒光素標記，用 IFA 法檢測肝細胞中 HEAg，也可用免疫熒光抗體阻斷法檢測血清中抗-HEV。

2.3 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

抗原應包括當地主要結構基因編碼的蛋白。應用桿狀病毒為載體，在昆蟲細胞（真核）表達的 ORF2 和 ORF3 結構蛋白羧基端（C 端），其抗原表位構象接近自然狀態(tài)，具有很高免疫原性。用純化的抗原蛋白包被在微量塑料板孔內，加入被檢血清，然后加入抗人 IgG（γ 鏈）、或抗人 IgM（μ 鏈）、或抗人 IgA（α 鏈）酶結合物，再加入底物顯色。分別檢測血清標本中 IgG、IgM 或 IgA 抗體[10]。現已研制出第3 代 ELISA 診斷試劑，并已商品化。國內用大腸桿菌（原核）表達的抗原制備 ELISA 試劑盒，也能取得良好檢測效果。用原核或真核表達的 ORF2 和 ORF3 抗原蛋白，對急性期血清有較強活性，但對恢復期血清反應性較差。ELISA 已成為HEV 感染的診斷常規(guī)檢測技術。

2.4 蛋白印跡試驗（Western blot assay，WBA）

其靈敏度和特異性均較 ELISA 為高。將聚丙烯酰胺凝膠上的 HEV 融合蛋白轉移到硝基纖維膜上，與被檢血清中的 IgG、IgM 或 IgA 作用，加入抗人 IgG（γ 鏈）、抗人 IgM（μ 鏈）或抗人 IgA（α 鏈）酶結合物，再加入底物顯色。

2.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）

檢測患者血清和糞便中的 HEV RNA。先從被檢標本中提取 RNA，逆轉錄為cDNA，在相應引物引導下進行基因擴增，其產物經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，置紫外燈下觀察，通過與標準分子量的 DNA 比較，作出結果判斷。在我國流行的 HEV 基因是 1 型和 4 型，根據這兩型序列的保守區(qū)域設計的引物，檢測 HEV RNA 的靈敏度高于通用引物。本法靈敏度高，特異性強，但在操作過程中易發(fā)生實驗室污染而出現假陽性結果。也可用實時熒光定量RT-PCR 檢測 HEV RNA，其比 RT-PCR 靈敏 10～100 倍。

2.6 核苷酸序列分析（nucleic acid sequence analysis）

從患者血清提取 HEV RNA，通過 RT-PCR 擴增 ORF2區(qū) cDNA 片段，對擴增產物進行純化。采用 Sequence Version 2.0 DNA 序列分析試劑盒，以同位素 γ-32P 末端標記引物，經雙脫氧核苷酸 DNA 鏈末端終止直接測序法，測定擴增產物核苷酸序列。此法用于病毒分型、傳染源探索和分子流行病學研究。

3 HEV 感染的流行特征

3.1 傳染源

人和靈長類動物、家畜和家禽都可作為傳染源。豬是人類 HEV 感染的病毒存儲庫，是主要傳染源和動物宿主[11]。曾從屠宰場污水、豬圈外排水道標本分離出病毒。亞臨床型感染者是戊型肝炎的主要傳染源。潛伏期末期和急性期早期的患者傳染性最強。戊型肝炎潛伏期比甲型肝炎更長。

3.2 傳播途徑

3.2.1 經水傳播 水源被患者糞便或動物糞便污染，常引起暴發(fā)性流行。歷史上幾次大的流行都與水源被污染有關。

3.2.2 經食物傳播 食物在生產、加工和流通過程中被病毒污染，可引起家庭內和集體食堂內的小型暴發(fā)。豬肉、豬肝、鹿肉和海產品能攜帶病毒，食用未煮熟的豬肉、豬肝、鹿肉和海鮮都能引起發(fā)病[12]。2009年頒布的《食品衛(wèi)生法》首次將戊型肝炎列為食品從業(yè)人員健康體檢的必檢項目。

3.2.3 人與人之間傳播 人感染后，從糞便排出病毒時間較長，病毒在自然界不易被滅活。人與人之間可通過糞口途徑腸道傳播或日常生活接觸傳播。2007 – 2009年在烏干達難民營的戊型肝炎疫情中，HEV 發(fā)生了人與人之間的傳播。沒有通過性傳播的報道[13]。

3.2.4 垂直傳播 懷孕婦女感染病毒，病毒通過胎盤使胎兒感染。印度曾報告，孕婦 HEV RNA 陽性，其新生兒100%發(fā)生急性戊型肝炎。

3.2.5 經血液傳播 輸入含有 HEV 的血液，使受血者發(fā)生戊型肝炎。病毒血癥時間很短，但輸血不是主要傳播方式。

3.2.6 媒介傳播 蒼蠅和蟑螂等節(jié)肢動物將糞便中的病毒帶到食物上造成疾病傳播。

3.3 易感人群

人群普遍對 HEV 易感。兒童感染 HEV，多為隱性感染；成人則多顯性感染。病后有一定免疫力。

3.4 流行病學特征

3.4.1 地區(qū)分布 戊型肝炎是一種世界性傳染病。在世界很多國家和地區(qū)有過散發(fā)或暴發(fā)。印度新德里在 1955年發(fā)生水型流行后，每隔數年都要發(fā)生流行，并擴散到整個印度次大陸。1991年2月和 4月，在印度坎普爾發(fā)生了7.9 萬例病人的大流行。據歷史記載，發(fā)生萬人以上的暴發(fā)已有 9 次之多。在非洲尼羅河流域，散發(fā)肝炎中 HEV 是主要致病因子。在美、英、日等發(fā)達國家旅游者到疫區(qū)旅游，感染了病毒，回國后發(fā)病[14]，也可由當地的動物傳播而引起的散發(fā)病例。在我國大部分省區(qū)都有過本病的散發(fā)或暴發(fā)流行的報道。

3.4.2 性別和年齡分布 散發(fā)時，男性發(fā)病多于女性。發(fā)病以青壯年為主。

3.4.3 季節(jié)分布 有明顯季節(jié)性，雨季多見。洪水后易發(fā)生流行。

4 HEV感染的預防

4.1 一般性預防措施

采用切斷傳播途徑為主的綜合性預防措施。加強飲用水衛(wèi)生管理，保護水源。改善供水條件，保證安全用水。加強環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督和食品衛(wèi)生監(jiān)督，改善居住條件，合理處理人畜禽糞便，防止糞便污染水源和周圍環(huán)境。加強衛(wèi)生宣傳教育，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習慣，提倡喝開水，不喝生水。不要食用半生不熟的毛蚶和海蟹等貝殼類水產品。孕婦要遠離戊型肝炎患者。加工豬肉、海產品時要做到生熟分開。到疫區(qū)旅行時，要特別注意飲食衛(wèi)生。

4.2 疫苗免疫

接種疫苗是預防戊型肝炎最主要的措施。目前正在研制的疫苗有基因工程疫苗、DNA 疫苗和重組蛋白疫苗等[15-16]。

由國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心（廈門大學夏寧邵團隊）等單位聯合研制的戊型肝炎疫苗取得了重大成果。病毒基因來源于 HEV 基因 1 型，抗原片段選用HEV 結構蛋白 ORF2，選用大腸桿菌（原核）表達系統。大腸桿菌表達系統制備的疫苗在人群中免疫已經受了 20多年考驗，在安全性上沒有出現過問題。此疫苗再現了 HEV主要中和表位，具有優(yōu)異免疫原性，能刺激機體產生高效價中和抗體。該團隊闡明了 HEV 中和表位的結構基礎，成功利用大腸桿菌表達系統獲得了戊型肝炎病毒顆粒，解決了基因工程疫苗免疫原性偏低的難題，使重組疫苗正式進入產業(yè)化進程。研究前后歷時 5年，經靈長類動物保護性試驗和III 期臨床 12 萬名志愿者參加的試驗證實，國產戊型肝炎疫苗安全有效，安全性指標達到美國和歐盟的最高標準。在注射疫苗一年內，使用安慰劑的受試者中有 15 人感染了戊型肝炎，而使用疫苗的人中無一人感染病毒。人工免疫后，沒有發(fā)現疫苗有嚴重毒副作用[17]。該疫苗生產廠房已在福建廈門海滄生物醫(yī)藥產業(yè)園完成建設，一旦獲得國家藥監(jiān)部門批準，即可組織生產，滿足市場需求。戊型肝炎疫苗在中和表位、類病毒顆粒結構和大腸桿菌表達工藝等核心環(huán)節(jié)均擁有發(fā)明專利和完整的自主知識產權。這種疫苗一旦上市，將成為我國第一個原創(chuàng)基因工程病毒疫苗，世界上第三個基因工程疫苗?？鐕呙缟a企業(yè)對合作開發(fā)該疫苗的國際市場表示了濃厚興趣。

Purcell 等[18]應用昆蟲細胞/桿狀病毒載體表達 ORF2蛋白片段，通過內切酶將衣殼蛋白依次進行切割，發(fā)現62 kD 和 56 kD 片段保護性能良好，56 kD 片段也很穩(wěn)定。經恒河猴試驗，56 kD 重組蛋白制成的疫苗預防效果良好。葛蘭素-史克公司（GSK）用此重組疫苗在尼泊爾軍隊近2000 名志愿者中采用雙盲隨機試驗，其中半數人接種疫苗，半數人接種安慰劑。疫苗有效率達到 95.5%，未發(fā)現不良反應。但用昆蟲細胞表達系統制成的疫苗以往尚無在人群中免疫的成功報道。因此，此疫苗要進入臨床尚有待時日。

5 結語

戊型肝炎是一種急性胃腸道傳染病，又是人畜禽共患的疾病。戊型肝炎的流行與當地經濟狀況和衛(wèi)生習慣密切相關。我國是戊型肝炎高流行區(qū)，加強戊型肝炎的防治工作成為當前迫切的任務，采用切斷傳播途徑為主的綜合性預防措施可控制該病流行。我國已研制成功高效、安全、具有完整知識產權的疫苗，這種疫苗一旦獲得批準上市，將成為我國第一個原創(chuàng)基因工程病毒疫苗。人們期待國產疫苗在未來戊型肝炎預防中發(fā)揮應有的作用。

[1]Purcell RH, Emerson SU.Hepatitis E: an emerging awareness of an old disease.J Hepatol, 2008, 48(3):494-503.

[2]Gupta DN, Smetana HF.The histopathology of viral hepatitis as seen in the Delhi epidemic (1955-56).Indian J Med Res, 1957, 45(Suppl):101-113.

[3]Takahashi M, Kusakai S, Mizuo H, et al.Simultaneous detection of immunoglobulin A(IgA) and IgM antibodies against hepatitis E virus(HEV) is highly specific for diagnosis of acute HEV infection.J Clin Microbiol, 2005, 43(1):49-56.

[4]Mushahwar IK.Hepatitis E virus: molecular virology, clinical features,diagnosis, transmission, epidemiology, and prevention.J Med Virol,2008, 80(4):646-658.

[5]Sonoda H, Abe M, Sugimoto T, et al.Prevalence of hepatitis E virus(HEV) Infection in wild boars and deer and genetic identification of a genotype 3 HEV from a boar in Japan.J Clin Microbiol, 2004, 42(11):5371-5374.

[6]Rolfe KJ, Curran MD, Mangrolia N, et al.First case of genotype 4 human hepatitis E virus infection acquired in India.J Clin Virol, 2010,48(1):58-61.

[7]Song YJ.Studies of hepatitis E virus genotypes.Indian J Med Res,2010, 132(5):487-488.

[8]Guu TS, Liu Z, Ye Q, et al.Structure of the hepatitis E virus-like particle suggests mechanisms for virus assembly and receptor binding.Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(31):12992-12997.

[9]Tei S, Kitajima N, Takahashi K, et al.Zoonotic transmission of hepatitis E virus from deer to human beings.Lancet, 2003, 362(9381):371-373.

[10]Khudyakov YuE, Favorov MO, Jue DL, et al.Immunodominant antigenic regions in a structural protein of hepatitis E virus.Virology,1994, 198(1):390-393.

[11]Li TC, Zhang J, Shinzawa H, et al.Empty virus-like particle-based enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to hepatitis E virus.J Med Virol, 2000, 62(3):327-333.

[12]Takahashi M, Nishizawa T, Okamoto H.Identification of a genotypeⅢ swine hepatitis E virus that was isolated from a Japanese pig born in 1990 and that is most closely related to Japanese isolates of human hepatitis E virus.J Clin Microbiol, 2003, 41(3):1342-1343.

[13]Thomas DL, Yarbough PO, Vlahov D, et al.Seroreactivity to hepatitis E virus in areas where the disease in not endemic.J Clin Microbiol,1997, 35(5):1244-1247.

[14]Miyahara K, Miyake Y, Yasunaka T, et al.Acute hepatitis due to hepatitis E virus genotype 1 as an imported infectious disease in Japan.Intern Med, 2010, 49(23):2613-2616.

[15]Shrestha MP, Scott RM, Joshi DM, et al.Safety and efficacy of a recombinant hepatitis E vaccine.N Engl J Med, 2007, 356(9):895-903.

[16]Zhang M, Emerson SU, Nguyen H, et al.Recombinant vaccine against hepatitis E: duration of protective immunity in rhesus macaques.Vaccine, 2002, 20(27-28):3285-3291.

[17]Zhu FC, Zhang J, Zhang XF, et al.Efficacy and safety of a recombinant hepatitis E vaccine in healthy adults: a large-scale,randomised, double-blind placebo-controlled, phase 3 trial.Lancet,2010, 376(9744):895-902.

[18]Purcell RH, Nguyen H, Shapiro M, et al.Pre-clinical immunogenicity and efficacy trial of a recombinant hepatitis E vaccine.Vaccine, 2003,21(19-20):2607-2615.