耐藥結(jié)核病分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展

張軍

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，是目前傳染病中威脅人類健康的頭號(hào)殺手。耐藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)，已成為新世紀(jì)結(jié)核病控制的三大難題之一。耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）和廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug－resistant tuberculosis，XDRTB），是21世紀(jì)全球所面臨的最為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，MDR－TB則有可能使結(jié)核病再度成為“不治之癥”，遏制耐藥結(jié)核病已經(jīng)成為非常迫切的研究課題。

分子生物學(xué)是指從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的一門學(xué)科。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是其中的一個(gè)重要分支，它以疾病為中心，用分子理論和技術(shù)來研究人類疾病的預(yù)防、診斷、治療和發(fā)病機(jī)制等。分子生物學(xué)的發(fā)展為研究結(jié)核病耐藥性及結(jié)核病的傳播和流行開辟了一條新的途徑。筆者就耐藥結(jié)核病的分子生物學(xué)研究、結(jié)核病耐藥快速檢測(cè)方法及基因分型技術(shù)的研究進(jìn)行了概述。

耐藥結(jié)核病的概念

1992年6月美國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）發(fā)表的有關(guān)耐藥肺結(jié)核的文章中，正式提出MDR－TB的概念。2006年，世界衛(wèi)生組織（WHO）出版了《WHO耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南》［1]，規(guī)范了耐藥概念：（1）單耐藥（mono－resistance）：結(jié)核分枝桿菌對(duì)1種一線抗結(jié)核藥物耐藥；（2）多耐藥（polyresistance）：結(jié)核分枝桿菌對(duì)不包括同時(shí)耐利福平、異煙肼在內(nèi)的1種以上的一線抗結(jié)核藥物耐藥；（3）MDR－TB：是指患者排出的痰液中結(jié)核分枝桿菌至少對(duì)異煙肼和利福平2種抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥的結(jié)核?。?]。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室藥敏報(bào)告結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)異煙肼、利福平耐藥，或經(jīng)WHO標(biāo)準(zhǔn)復(fù)治方案（2HREZS／1HREZ／5HRE）治療，仍然痰菌陽(yáng)性，即可判斷為 MDR－TB［3]。

2006年3月24日，美國(guó)CDC首次提出廣泛耐藥結(jié)核病（extensively drug－resistant，XDR）的概念，即對(duì)異煙肼、利福平耐藥，并且至少對(duì)6類二線抗結(jié)核藥（氨基甙類、多肽類、氟喹諾酮類、環(huán)絲氨酸、硫胺類、對(duì)氨基水楊酸鈉）中3類藥物耐藥的結(jié)核?。?]。同時(shí)對(duì)任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及至少對(duì)1種二線抗結(jié)核注射劑（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）耐藥。2006年10月在日內(nèi)瓦會(huì)議上 WHO將XDR－TB定義為：在 MDR－TB的基礎(chǔ)上，還對(duì)氟喹諾酮類藥物中的1種以及至少對(duì)以下3種注射藥物：卷曲霉素、卡那霉素和丁胺卡那霉素中的1種產(chǎn)生耐藥的結(jié)核?。?，5]。XDR目前在世界范圍內(nèi)最受關(guān)注，對(duì)社會(huì)、人類造成的危害也最大，在世界各國(guó)均有流行，是目前最為嚴(yán)重的一種結(jié)核病，治愈率很低，病死率極高［6]。

結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制

隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的進(jìn)展，抗結(jié)核藥物的耐藥機(jī)制逐漸被闡明。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性主要是由不合理用藥引起的結(jié)核分枝桿菌內(nèi)抗結(jié)核藥物作用靶基因突變所致，突變導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐藥的自然和獨(dú)立發(fā)生。具有先天耐藥突變的少量菌株在合理的耐多藥結(jié)核病治療期間很容易治愈。不充分治療和單藥治療會(huì)導(dǎo)致耐多藥菌株增殖，最終導(dǎo)致臨床上耐藥菌株的顯著增加。近年國(guó)內(nèi)外研究報(bào)告指出，耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株藥物靶編碼基因發(fā)生突變，與耐藥性密切相關(guān)，是結(jié)核分枝桿菌耐藥性的主要分子機(jī)制。

結(jié)核分枝桿菌的耐藥分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)異煙肼（isoniazid，INH）的耐藥性主要是由于過氧化氫－過氧化物酶的編碼基因（katG）突變或缺失或烯?；€原酶編碼基因（inhA）突變以及烷基過氧化氫酶C編碼基因（ahpc基因）的突變［7]；結(jié)核分枝桿菌耐受利福平（rifampicin，RFP）主要是由于編碼RNA聚合酶的rpoB基因突變，使RFP與RNA聚合酶親和力明顯減小所致，現(xiàn)已知96%～99%的RFP耐藥性是由于rpoB基因中81bp核心區(qū)域的突變所引起［8]；鏈霉素（stréptomycin，SM）的耐藥主要是由于核糖體30S亞基S12蛋白的編碼基因（rpsl）和／或16SrRNA編碼基因（rrs）突變［8]；embB 基因突變是乙胺丁醇（ethambutol，EMB）耐藥性產(chǎn)生的主要原因，其次是embA基因突變；結(jié)核分枝桿菌耐受吡嗪酰胺（pynaziamide，PZA）主要是由于其吡嗪酰胺酶編碼基因（pncA）發(fā)生突變，使吡嗪酰胺酶活性喪失，不能將PZA轉(zhuǎn)變成活性型所致；編碼DNA螺旋酶A亞單位的gyrA基因發(fā)生突變是結(jié)核分枝桿菌耐受喹諾酮類藥物的共同機(jī)制。耐丁胺卡那霉素（阿米卡星，Amikacin，Amk）和卡那霉素（kanamycin，Km）的結(jié)核分枝桿菌中，ns基因突變?yōu)椋?7.4%），最常見的突變是1401位點(diǎn)A→G單堿基置換（60.5%）［9]，少數(shù)分離株為（1402位）C→T 或 A、（1484位）C→T，這些突變主要發(fā)生于高水平耐藥株，32.6%的耐Km分離株未發(fā)現(xiàn)ns基因突變，可能還存在其他耐藥機(jī)制。卷曲霉素（capreomycin，Cm）和紫霉素（viomycin，Vio）在結(jié)構(gòu)上相似，結(jié)核分枝桿菌對(duì)Cm和Vio耐藥是由于tlyA基因（編碼rRNA修飾酶2′－O－甲基轉(zhuǎn)移酶）和ns基因突變所致，其中tlyA基因突變是耐藥性產(chǎn)生的重要原因。結(jié)核分枝桿菌基因ethA和ethR與乙硫異煙胺耐藥有關(guān)［9]。

但是并不是所有耐藥菌株均與相應(yīng)基因突變有關(guān)，如部分臨床耐INH株約10%～20%未檢測(cè)到KatG、inhA基因改變，但存在編碼烷基過氧化氫還原酶亞單位的ahpC基因突變。少數(shù)耐RIF菌株并無rpoB突變，同時(shí)在少數(shù)敏感株組3%檢測(cè)到rpoB基因突變，提示RIF耐藥尚有其他機(jī)制［10]。

TB耐藥的主要機(jī)制是由于耐藥基因如rpsL、rpoB、katG、pncA、embB等突變所致，部分由于堿基缺失或插入所致，可能與遺傳相關(guān)［11]。大多數(shù)的耐多藥菌株是各種藥物作用靶分子的編碼基因逐步突變累積所致，而且各種突變之間存在一定的關(guān)聯(lián)，即染色體多個(gè)相互獨(dú)立基因自發(fā)突變的逐步累加是耐多藥的分子基礎(chǔ)，還未發(fā)現(xiàn)由單一突變引起的耐多藥菌株［10]。Morris等［12]研究表明，55%的耐多藥結(jié)核分枝桿菌同時(shí)存在rpoB、rpsl和katG基因突變。

目前國(guó)內(nèi)外耐藥結(jié)核分枝桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的問世，建立于PCR基礎(chǔ)上的突變檢測(cè)技術(shù)也不斷涌現(xiàn)。利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法來研究基因突變與耐藥性的關(guān)系，為耐藥性的快速測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。

1.DNA直接測(cè)序技術(shù)（DNA sequencing）：是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變最直接、可靠的方法，是其他分子生物學(xué)方法的基礎(chǔ)。它利用PCR法擴(kuò)增待測(cè)耐藥基因，產(chǎn)物純化或克隆化后取DNA片段直接測(cè)序，其堿基序列與標(biāo)準(zhǔn)敏感株的同一DNA片段比較異同，尋找堿基突變的位置和分布。該方法具有高通量、自動(dòng)化程序高、自動(dòng)數(shù)據(jù)處理等特點(diǎn)，已成功地應(yīng)用于檢測(cè)rpoB、ndh、katG、rrs、rpsL等［13－15]位點(diǎn)的突變，24～48h即可提供精確序列，還可發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)及應(yīng)用于流行病學(xué)研究。但該法需在專門實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，操作煩瑣，費(fèi)用昂貴，因此限制了它在臨床推廣應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多用該方法作為評(píng)價(jià)其他檢測(cè)方法的參考。另外新一代DNA測(cè)序技術(shù)焦磷酸測(cè)序技術(shù)也開始用于基因多態(tài)性和耐藥基因的檢測(cè)，但該技術(shù)目前只能分析20～40bp的短序列，尚需進(jìn)一步改進(jìn)。

2.PCR－單鏈構(gòu)象多態(tài) 性分析 （polymerase chain reaction－single strand conformation polymorphism，PCR－SSCP）：其原理是在某一條件下，單鏈（ss）核酸在溶液中會(huì)形成一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其堿基的組成會(huì)影響二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。利用DNA單鏈構(gòu)象具有多態(tài)性的特點(diǎn)，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，以無突變的DNA序列為對(duì)照，比較待測(cè)DNA與對(duì)照DNA在凝膠中遷移率的改變，就可判定待測(cè)序列中有無突變。與測(cè)序技術(shù)相比，PCR－SSCP操作簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異，成為使用較廣泛的檢測(cè)耐藥結(jié)核菌突變技術(shù)之一，如檢測(cè)rpoB、katG、rpsL 基因［13－15]等。但由于受檢測(cè) DNA片段長(zhǎng)度、膠的濃度、緩沖液的離子強(qiáng)度及電泳時(shí)的溫度等影響，并且SSCP還不能給出突變的具體位置和突變性質(zhì)，只能用于基因突變的篩選，因此限制了它的實(shí)際應(yīng)用。

3.PCR－異源雙鏈形成 法 （PCR－universal heteroduplex generator，PCR－UHG）：Williams等［16]創(chuàng)立了在6h內(nèi)獲得快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥性的方法：先用巢式PCR擴(kuò)增特異的rpoB基因片段，再與根據(jù)結(jié)核菌rpoB基因Rif區(qū)合成的通用異源雙鏈擴(kuò)增子UHG（universal heteroduplex generator）探針雜交，如果標(biāo)本中的結(jié)核菌rpoB基因無突變，則形成同源雙鏈構(gòu)象，電泳后呈1條區(qū)帶；有突變，則形成異源雙鏈構(gòu)象，電泳后除出現(xiàn)代表同源雙鏈構(gòu)象的區(qū)帶外還出現(xiàn)其他條帶，確定其是否有RFP耐藥性。此方法對(duì)涂片染色陽(yáng)性、未經(jīng)治療的患者尤為適合。值得注意的是，PCR－UHG是依據(jù)rpoB基因Rif區(qū)的核苷酸變化來確定其耐藥性的，少數(shù)標(biāo)本有耐藥表現(xiàn)型（用BACTEC檢測(cè)），但不能查到其基因型變異，其耐藥機(jī)制可能是在Rif區(qū)外，或不在rpoB基因。Thomas等［17]應(yīng)用該方法檢測(cè)RFP耐藥菌株，敏感度和特異度分別為83.0%和98.2%。

4.PCR－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 （PCR－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）：因?yàn)榛蛲蛔儯谙拗菩詢?nèi)切酶酶切DNA片段時(shí)，其長(zhǎng)度會(huì)發(fā)生變化，電泳得到其多態(tài)性變化。Nachamkin等［18]進(jìn)行了一系列試驗(yàn)來檢測(cè)結(jié)核菌的耐藥性，RFLP用于katG和rpsL基因突變的檢測(cè)，其特異度達(dá)100%，但其靈敏度卻只有28%；而檢測(cè)rpoB基因的異源雙鏈分析達(dá)到76%的靈敏度和97%的特異度。此法特異度較高，能分析已知序列是否存在某個(gè)位點(diǎn)的突變，但不知突變的性質(zhì)。由于不是所有突變都可以獲得或者限制性酶切位點(diǎn)的缺失，而限制了其在臨床上的應(yīng)用［19]。

5.PCR－反向斑點(diǎn)雜交方法（PCR－reverse dot blot，PCRRDB）：該方法的原理是應(yīng)用生物素或地高辛修飾的特異引物擴(kuò)增DNA，特異寡核苷酸探針同PCR產(chǎn)物雜交與否來決定耐藥相關(guān)基因突變的存在狀態(tài)。該方法優(yōu)勢(shì)在于可以直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)能夠一次對(duì)多種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)并確定耐藥基因突變的部位和性質(zhì)，快速精確，具重復(fù)性，技術(shù)要求簡(jiǎn)單，標(biāo)本可批量處理，因此極具推廣應(yīng)用的潛力。目前，比利時(shí)的Innogenetics公司和德國(guó)的Hain Lifescience公司已推出PCR－RDB MTB檢測(cè)試劑盒，用于分析RFP耐藥基因型，獲得較好的結(jié)果［20]。

6.基因芯片技術(shù)：其原理是將已用熒光標(biāo)記的核苷酸靶序列（待測(cè)菌的DNA或RNA）與固定在芯片上的基礎(chǔ)探針雜交，通過激光共聚焦熒光掃描或電荷偶聯(lián)攝像機(jī)對(duì)每個(gè)探針分子的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，以此來獲取待測(cè)標(biāo)本分子的數(shù)量和序列信息。DNA芯片在確定PCR產(chǎn)物序列方面具有廣闊的應(yīng)用前景，它的出現(xiàn)為僅用一次雜交確定大量序列提供了可能性。該方法的可行性已通過對(duì)人線粒體基因組完整序列的分析得到證實(shí)。利用基因芯片探針雜交方法可以對(duì)2個(gè)以上不同的耐藥性基因同時(shí)進(jìn)行分析，如結(jié)核分枝桿菌對(duì)INH、RFP、EMB、PZA等多種藥物的耐藥基因都可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)具有無可比擬的高效、快速和多參量的特點(diǎn)，是目前分子生物學(xué)最前沿的方法，可準(zhǔn)確地確定突變位點(diǎn)和突變類型，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)核的菌種鑒定、耐藥性檢測(cè)及其基因組比較分析等研究領(lǐng)域［10]。

7.變性梯度凝膠電泳（DGGE）：其原理是雙鏈DNA在遞增的變性劑濃度梯度或溫度梯度中電泳時(shí)，DNA不同區(qū)段可根據(jù)不同的溶解溫度（Tm）而解離。雜交體中堿基的錯(cuò)配會(huì)造成相應(yīng)區(qū)段的不穩(wěn)定，致使同源體和雜交體之間相應(yīng)區(qū)段的Tm差異可達(dá)6℃，野生型和突變型單鏈所形成的雜交體即可被區(qū)分出來。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通過預(yù)試驗(yàn)來確定其最佳的電泳條件，以獲得最大的分離度。這需要一定的電泳條件，實(shí)驗(yàn)室可自行操作。

8.熒光定量PCR：PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過程，任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒有一個(gè)固定的比例關(guān)系，通過檢測(cè)擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來研究人員通過大量的實(shí)踐，研究了相對(duì)準(zhǔn)確的定量PCR方法，即熒光定量PCR，目前熒光定量PCR均采用外標(biāo)定量。其主要原理：熒光共振能量轉(zhuǎn)移，外來光源激發(fā)供體熒光染料發(fā)出熒光，當(dāng)其發(fā)射波長(zhǎng)與受體熒光染料的吸收波長(zhǎng)部分重疊，且兩者距離很近時(shí)，受體熒光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)將供體熒光淬滅。熒光定量PCR有如下顯著的優(yōu)點(diǎn)：特異度好，靈敏度高，線性關(guān)系好、線性范圍寬，操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染、速度快、高通量、可在2～3h完成96個(gè)樣品的定量分析［21]。

9.分子信標(biāo)：為一莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，其環(huán)狀區(qū)核苷酸序列與靶核酸互補(bǔ)，靠近兩端的部分序列互補(bǔ)構(gòu)成分子信標(biāo)的莖部，兩末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。當(dāng)靶核酸存在時(shí)，莖部結(jié)構(gòu)結(jié)合靶序列而打開，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開，產(chǎn)生熒光，熒光多少與莖部結(jié)構(gòu)同靶序列結(jié)合的程度有關(guān)。

10.枝鏈DNA（bDNA）：是一個(gè)多重雜交系統(tǒng)，其檢測(cè)靈敏度大大提高。將靶DNA與固相固定的特異探針雜交，再加入另一特異探針與靶DNA雜交，此探針可結(jié)合一樹枝狀bDNA，標(biāo)記有（AP）的探針與bDNA結(jié)合，加入發(fā)光底物，用發(fā)光檢測(cè)儀來測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度，靈敏度高，接近PCR水平。已有人將此法用于細(xì)菌耐藥性檢測(cè)。

總之隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)方法有一定的進(jìn)展，但應(yīng)看到并不是每種藥物只有一種耐藥基因，臨床的檢測(cè)手段在實(shí)際應(yīng)用中有各方面的局限性，因此應(yīng)尋找每種藥物全部耐藥基因，以及基因與耐藥之間的關(guān)系，建立快速、簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方法對(duì)其耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，以指導(dǎo)臨床的早期治療和有效的控制結(jié)核病。

展 望

耐藥現(xiàn)象大大削弱了抗結(jié)核藥物的療效。早期檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性，對(duì)控制結(jié)核病極為重要。目前用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性監(jiān)測(cè)的傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足臨床治療的需求，因此，國(guó)內(nèi)外都在尋找1種快速而且靈敏度高的監(jiān)測(cè)方法，以期快速的給臨床治療提供依據(jù)。由于結(jié)核菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，常有多重耐藥，其耐藥性檢測(cè)也應(yīng)選擇合適的方法，檢測(cè)多個(gè)耐藥基因，并結(jié)合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。目前DNA芯片技術(shù)發(fā)展迅速，可在同一載體上進(jìn)行多個(gè)基因檢測(cè)，其具有高密度、高容量的特點(diǎn)，可導(dǎo)致一個(gè)量變到質(zhì)變的過程，將是非常好的耐藥性檢測(cè)手段。這樣可以在1個(gè)芯片上檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)幾種藥物的耐藥性，即加快了監(jiān)測(cè)速度又節(jié)約了成本。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)在鑒定結(jié)核分枝桿菌耐藥性方面比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法有明顯的優(yōu)勢(shì)，但由于結(jié)核分枝桿菌的耐藥性與基因突變的確切關(guān)系尚未完全闡明，加之生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)靈敏度的限制（對(duì)某些藥物缺乏敏感度），基因突變型和其耐藥表型的不一致，以及未發(fā)現(xiàn)的耐藥基因的存在，使目前分子生物學(xué)檢測(cè)尚不能完全取代常規(guī)培養(yǎng)法來鑒定結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)的應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊，建立簡(jiǎn)便、靈敏、特異的快速測(cè)定方法，可以及時(shí)地為臨床治療提供依據(jù)。

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