結(jié)核病若干問題研究進展

成詩明 莊玉輝

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2010年全球結(jié)核病控制報告顯示［1]，2009年全球新發(fā)結(jié)核病患者940萬，共有結(jié)核病患者1400萬，死于結(jié)核病者130萬。結(jié)核病給人類的健康帶來了如此巨大的負(fù)擔(dān)，人類一直致力于結(jié)核病診斷、治療、預(yù)防等方面的研究。筆者將從以下5個方面來介紹結(jié)核病研究的一些進展。

結(jié)核分枝桿菌基因組和后基因組學(xué)的研究

隨著人類基因組計劃的成功完成，人類在破譯生命密碼的征程上邁出了堅實的一步。在此背景下，人類對模式生物如酵母、線蟲、果蠅、小鼠等的基因測序也相繼完成。1998年英國Sanger中心和法國Pasteur研究所的科學(xué)家合作完成了結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的基因組測序工作，結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組大小為4 411 529bp，G＋C含量為65.6%，編碼3988種蛋白質(zhì)［2]。這標(biāo)志著結(jié)核分枝桿菌的研究已經(jīng)進入了基因組時代。

隨著人類進入21世紀(jì)，人類基因組的研究正在逐漸跨入后基因組時代。后基因組學(xué)又稱為功能基因組學(xué)［3]，是在基因組學(xué)前期研究成果，主要是結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究所獲得的信息和產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，全面、系統(tǒng)的分析基因的功能，力圖在基因組水平上對其基因的活動規(guī)律進行闡述。目前研究進展比較快的領(lǐng)域包括比較基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。比較基因組學(xué)是一種鑒定生物體間基因組差異，研究遺傳變異，闡明生物體間生理、生化、毒力差異的有效方法。比較基因組學(xué)的研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群各菌種在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）水平上同源性大于99.95%［4]。熊志紅等［5]用差異分析技術(shù)分析了結(jié)核分枝桿菌強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra在體外培養(yǎng)條件下基因表達的差異，通過20種引物組合進行mRNA差異顯示，克隆到了兩菌株間的20余個差異表達基因，經(jīng)序列分析及雜交鑒定發(fā)現(xiàn)其中2個基因僅在H37Rv中表達，而在H37Ra中沒有表達。比較基因組分析的結(jié)果顯示了不同結(jié)核分枝桿菌遺傳的多樣性，這可能與不同疫苗的效果不同有關(guān)［6]。

蛋白質(zhì)組學(xué)可以全面分析細(xì)胞在穩(wěn)定條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的概況。應(yīng)用蛋白質(zhì)組可以檢測到基因組中未能檢測到的基因，是對基因組分析方面的補充。蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要技術(shù)有［7]：規(guī)?；鞍踪|(zhì)微量鑒定、二維或雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)譜；“差異顯示”蛋白質(zhì)組學(xué)；應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)或酵母雙雜交方法研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用等。目前應(yīng)用雙向凝膠電泳－質(zhì)譜分析技術(shù)，從細(xì)菌體外培養(yǎng)物中共檢測到2600種蛋白斑點，如果這些蛋白斑點都是不同的蛋白質(zhì)，則相當(dāng)于基因組學(xué)中預(yù)測蛋白質(zhì)總數(shù)的65%，進一步進行其功能學(xué)的研究將有極大的應(yīng)用價值［8]。

宿主結(jié)核病易感基因的研究

結(jié)核病的發(fā)病是多因素作用的結(jié)果。在暴露于結(jié)核分枝桿菌的人群中，只有10%的人會發(fā)?。?]。這說明結(jié)核病的發(fā)病不僅與環(huán)境暴露有關(guān)，宿主自身的遺傳因素對結(jié)核病的發(fā)病也起著重要作用。目前相關(guān)的研究主要集中在以下幾種基因：自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1（natural resistanceassociated macrophage protein 1，NRAMP1）基因、維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）基因，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）－DR基因、甘露糖結(jié)合凝集素（mannose binding lectin，MBL）基因等。

邵凌云等［10]通過病例對照研究明確了結(jié)核感染與NRAMP1基因多態(tài)性的關(guān)系。NRAMP1的不同基因多態(tài)性的協(xié)同作用導(dǎo)致了對結(jié)核病的易感性。

劉瑋等［11]采用病例對照研究設(shè)計，用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性分析檢測VDR基因中T／C多態(tài)性位點，在多因素分析中調(diào)整卡介苗接種史和吸煙狀況后，VDR－ff基因型與肺結(jié)核發(fā)病仍有顯著性關(guān)聯(lián)（調(diào)整OR＝3.036，95%CI：1.117～8.253）。VDR－ff 基因型可能是中國漢族人群肺結(jié)核病的易感基因型。

劉志輝等［12]研究發(fā)現(xiàn)HLA－DR16等位基因與南方漢族部分人群的肺結(jié)核的發(fā)病明顯關(guān)聯(lián)，或與真正起作用的易感基因連鎖，中國南方漢族部分人群DR1、DR13.3等位基因的表達對結(jié)核分枝桿菌感染者的發(fā)病可能具有拮抗作用。

劉瑋等［13]采用病例對照的方法對MBL基因多態(tài)性與中國漢族人群肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)聯(lián)進行了分析，結(jié)果顯示MBL基因XB組單倍體型與中國漢族人群肺結(jié)核發(fā)生的易感性顯著相關(guān)（調(diào)整OR＝1.60，95%CI：1.07～2.41）。

總而言之，目前的研究結(jié)果顯示人類肺結(jié)核易感性與基因多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，何種基因與結(jié)核病的易感性關(guān)系更為密切有待進一步的研究。相關(guān)研究的開展定能揭示結(jié)核病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，為結(jié)核病的基因治療提供思路，最終會對結(jié)核病的控制和預(yù)防發(fā)揮重要的作用。

結(jié)核病疫苗的研究

自1921年以來，由牛結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過13年230次傳代制成的減毒株－卡介苗（Bacille Calmette－Guérin，BCG）是目前世界上惟一批準(zhǔn)用于結(jié)核病預(yù)防的疫苗。BCG對于兒童重癥結(jié)核病如粟粒型結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎具有良好的預(yù)防保護效果［14]，但是其保護效力隨年齡增長而下降，一般為10～20年。對于青少年和成年人，其保護作用差異較大。有研究顯示BCG對成人肺結(jié)核的免疫保護作用為0%～80%［15]。鑒于BCG疫苗和單一的免疫方案的缺陷，對新型結(jié)核病疫苗和免疫接種方案的研究迫在眉睫。新型結(jié)核病疫苗不僅要對各年齡組未感染結(jié)核菌的人群提供良好的預(yù)防作用，同時要對已感染的人群提供消除體內(nèi)殘留的結(jié)核分枝桿菌，防止結(jié)核病復(fù)燃的保護作用。

目前正在研發(fā)的新型疫苗包括取代BCG的初免疫苗、增強BCG效果的加強疫苗、治療性結(jié)核病疫苗。（1）取代BCG的初免疫苗：以基因重組的活疫苗為代表?；蛑亟M的活疫苗通過將特定的基因?qū)隑CG株內(nèi)，使其表達結(jié)核分枝桿菌特異性抗原。以rBCG30為代表，該疫苗是已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗的第一個結(jié)核病新型疫苗，通過基因重組技術(shù)，使BCG株大量表達結(jié)核菌的重要保護性抗原Ag85B。（2）增強BCG效果的加強疫苗：以腺病毒或痘苗病毒為載體的疫苗屬于該類疫苗，通過表達免疫優(yōu)勢區(qū)抗原，激活免疫應(yīng)答；另一類加強疫苗是基因重組蛋白亞單位疫苗，是由2～3個結(jié)核分枝桿菌或BCG抗原優(yōu)勢區(qū)的抗原構(gòu)成，引起的保護性免疫應(yīng)答集中。但在體內(nèi)滯留時間短，需采用佐劑［16]。結(jié)核分枝桿菌的免疫性保護抗原主要是分泌性蛋白，包括早期分泌 抗原靶－6（ESAT－6）、抗原 85 復(fù) 合 體（Ag85）、CFP10、MPT63、MPT64、熱 休 克 蛋 白 HSP65、HSP70等。ESAT－6、Ag85是一些早期分泌抗原蛋白。近期一項研究顯示以ESAT－6、Ag85和潛伏相關(guān)蛋白R2660C構(gòu)建的H56疫苗，無論是在暴露前還是暴露后的預(yù)防中都表現(xiàn)出了良好的免疫效果［17]。R2660C在感染的早期和晚期均表達。在3種暴露前預(yù)防的小鼠模型中，H56對晚期感染的抑制效果要優(yōu)于以ESAT－6、Ag85構(gòu)建的H1疫苗及BCG疫苗。在結(jié)核菌潛伏感染的2種小鼠模型中，暴露后的H56接種能夠顯著降低疾病復(fù)發(fā)，并能顯著降低細(xì)菌負(fù)擔(dān)。（3）治療性結(jié)核病疫苗：將滅活疫苗作為輔助治療以縮短傳統(tǒng)的化學(xué)治療療程，目前該類疫苗包括母牛分枝桿菌疫苗、草分枝桿菌菌苗和結(jié)核分枝桿菌多糖核酸等。

2006—2015年全球控制結(jié)核病計劃中疫苗研發(fā)的主要目標(biāo)是2010年有2個疫苗進入臨床試驗，2015年有一個安全有效的新型疫苗上市。

截止到2010年，已經(jīng)有14個疫苗進入臨床試驗（表1），有6個結(jié)核病候選疫苗在臨床前試驗階段，還有33個新一代候選疫苗在研發(fā)早期。

結(jié)核病疫苗的研發(fā)面臨著許多挑戰(zhàn)［16]，如結(jié)核病疫苗的研發(fā)過程需要大量的資金投入，充實候選疫苗的產(chǎn)品線，同時建立大規(guī)模臨床試驗和生產(chǎn)能力，需要增強國家和社區(qū)對新型結(jié)核病疫苗需求的意識和支持等。

抗結(jié)核藥物的研究

目前臨床上使用的一線抗結(jié)核藥物主要有異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素等，這些藥物多數(shù)是在40多年前問世的，最晚的利福平也是在1965年問世的。結(jié)核病的治療主要依賴化療，但近40多年沒有突破性新藥問世，結(jié)核病化療時間長，化療方案復(fù)雜，同時結(jié)核分枝桿菌與艾滋病病毒雙重感染，耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生使當(dāng)前結(jié)核病防治陷入困境，亟需發(fā)展新的治療藥物。

新型抗結(jié)核藥物工作組（The Working Group on New TB Drugs）制定的結(jié)核病藥物的研發(fā)目標(biāo)為：（1）縮短治療療程至2個月或更少；（2）有效地治療耐多藥結(jié)核??；（3）為結(jié)核菌潛伏感染者提供治療服務(wù)。

目前處于臨床試驗階段的新型抗結(jié)核藥物包括［18]：一種是已經(jīng)作為一線或二線結(jié)核病的治療藥物，包括利福霉素類、氟喹諾酮類和嗯唑烷酮類，另一種是具有全新抗結(jié)核作用機制的藥物，包括硝基咪唑類、二芳基喹啉類、乙二胺四乙酸類和吡咯類。

目前處在臨床試驗階段藥物的研發(fā)進程見表2。

加替沙星和莫西沙星均屬于喹諾酮類藥物，目前正處于臨床Ⅲ期的評價階段。用于替換一線抗結(jié)核藥物乙胺丁醇（加替沙星和莫西沙星）或異煙肼（莫西沙星），療程從6～9個月可縮短為4個月。如果預(yù)期成功，提示這種方案將為縮短治療療程邁出重要一步［18]。OPC－67683和 PA－824均屬于硝基咪唑類藥物。PA－824目前正處于臨床Ⅱ期的研究

階段。PA－824在體外抑制活性試驗中，對包括耐藥菌株在內(nèi)的多種結(jié)核分枝桿菌都表現(xiàn)出了較高的活性，它對目前臨床使用的其他抗結(jié)核病藥物沒有表現(xiàn)出交叉耐藥性，并對靜止期的結(jié)核分枝桿菌表現(xiàn)出了體外抑制活性，是一個很有潛力的結(jié)核病治療候選化合物［19]。TMC－207屬于二芳基喹啉類藥物，通過抑制ATP合成酶來發(fā)揮作用。SQ－109屬于乙二胺四乙酸類藥物，該化合物通過抑制細(xì)胞壁的合成來發(fā)揮作用。LL3858屬于吡咯類藥物，目前該藥處于臨床Ⅰ期評價階段。

表1 臨床試驗階段的疫苗

表2 臨床試驗階段的藥物2006—2015年的研發(fā)進程［25]

目前抗結(jié)核藥物的研發(fā)過程同樣也面臨著重要的挑戰(zhàn)：新藥的研發(fā)成本投入非常高；臨床試驗耗時長；缺乏支持臨床Ⅱ和Ⅲ期結(jié)核病藥物試驗的合格生物標(biāo)記，也將使研發(fā)項目耗時較長、費用昂貴［18]。

結(jié)核病新型實驗室診斷方法的研究

結(jié)核病的早期、特異性的診斷是控制結(jié)核病死亡率的重要前提之一。結(jié)核病的實驗診斷的常規(guī)方法主要是痰涂片和痰培養(yǎng)。痰涂片鏡檢操作方便、廉價，但是陽性率較低，僅為30%～50%，其檢出靈敏度為104～105／L，屬于低靈敏度的方法［8]。熒光顯微鏡可以提高鏡檢的靈敏度，但是價格高，不適合基層使用。發(fā)光二極管（light－emitting diode，LED）顯微鏡價格優(yōu)于現(xiàn)在的熒光顯微鏡，壽命長。Meta分析顯示：LED顯微鏡的靈敏度比傳統(tǒng)鏡檢方法高約10%［20]。同時該方法費用低，可廣泛推廣使用。

痰培養(yǎng)是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，目前使用的培養(yǎng)基主要是固體羅氏培養(yǎng)基，需要4～6周的培養(yǎng)才能檢測到細(xì)菌的生長，對患者的早期診斷非常不利。目前采用液體培養(yǎng)的方法陽性率高于固體培養(yǎng)約10%～20%，同時較固體培養(yǎng)縮短了2～3周。我國熊禮寬等［21]曾報道，分枝桿菌變色液體培養(yǎng)基陽性率高，污染率低，檢出時間快。WHO推薦采用液體培養(yǎng)的方法用于艾滋病病毒感染者和病人合并肺結(jié)核的診斷。但是我國尚未全面推廣使用，只是在部分地區(qū)開展試點工作。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)的檢測技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛。目前分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法包括DNA探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、DNA指紋圖譜、DNA序列測定、DNA芯片技術(shù)等。其中PCR技術(shù)靈敏度在4%～80%之間波動，特異度為80%～100%［22]。該方法操作不嚴(yán)格易出現(xiàn)假陽性與假陰性。WHO目前推薦一種Cepheid Xpert的實驗室診斷方法，該種方法是一種全自動核酸擴增試驗，采用封閉的系統(tǒng)，2h即可獲得結(jié)果，采用該檢測方法可使耐藥結(jié)核病患者的診斷陽性率提高3倍，在結(jié)核病和艾滋病高流行地區(qū)的確診的TB／HIV患者數(shù)翻倍［23]。對5個檢測點（秘魯、阿塞拜疆、南非2個，印度）的1462例結(jié)核病的疑似患者進行檢測［24]，敏感度達到了97.6%（95%CI：96.2%～98.5%），特異度達到了98.0%（95%CI：96.6%～98.9%）［23]。但是由于該方法比較昂貴，限制了其在許多國家的推廣使用。

據(jù)估計全球結(jié)核病患者中1／2由潛伏感染者發(fā)展而來，結(jié)核菌感染者的早期診斷同樣是控制結(jié)核病的一項重要措施。目前各國致力于從結(jié)核分枝桿菌分離出的特異性抗原作為診斷試劑來識別結(jié)核分枝桿菌的早期感染。近年來，γ－干擾素（γ－IFN）釋放試驗（interferon－γrelease assays，IGRA）作為一種新型診斷結(jié)核感染的免疫學(xué)方法得到了越來越廣泛的應(yīng)用。該方法的設(shè)計原理是利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原會刺激致敏的淋巴細(xì)胞釋放γ－IFN，利用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）／酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）進行的γ－IFN的檢測。ELISA檢測抗原刺激后γ－IFN的含量，ELISPOT檢測抗原刺激后產(chǎn)生γ－IFN的外周血單個核細(xì)胞數(shù)，根據(jù)斑點的數(shù)量來確定細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況。從單細(xì)胞水平評價細(xì)胞免疫應(yīng)答功能，從而判斷結(jié)核分枝桿菌感染的情況。目前全血ELISA商品化的試劑盒有澳大利亞Cellestis公司的Quanti FERON－TB Gold（QFT－G）和 QuantiFERON－TB Gold In Tube（QFT－IT）。ELISPOT商品化的試劑盒是英國牛津公司的T－SPOT TB。

聯(lián)合國的千年發(fā)展目標(biāo)為到2015年結(jié)核病的發(fā)病率停止上升并逐漸下降；遏制結(jié)核病伙伴制定的相應(yīng)的目標(biāo)為到2015年，結(jié)核病患病率和死亡率在1990年基線上降低50%；到2050年，消除作為公共衛(wèi)生問題的結(jié)核病。世界各國目前正朝著這個方向積極努力，希望隨著各國政府承諾的增強，經(jīng)費投入的增加，在結(jié)核病的診斷、治療、預(yù)防等各個方面在未來都能取得突破，最終真正的實現(xiàn)一個無結(jié)核病世界的美好愿景。

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