海洋軟骨魚軟骨抗腫瘤物質(zhì)的研究進(jìn)展

馮 剛 ，王 斌 ，羅紅宇，曲有樂

（1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007）

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，每年死于癌癥的病人約占總死亡人數(shù)的四分之一，且發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，癌癥的防治成為醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)工作者主要研究的課題之一。目前用于癌癥治療的抗腫瘤藥物有幾十種，但對(duì)多數(shù)常見實(shí)體瘤仍缺乏有效藥物，且不少抗腫瘤藥在臨床應(yīng)用過程中產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。因此，篩選高效低毒的抗腫瘤藥物成為抗腫瘤新藥研發(fā)最為重要的任務(wù)。

軟骨魚類即軟骨魚綱，是僅存最古老的有頜脊椎動(dòng)物，主要包括鯊魚、魟魚、鰩和銀鮫等，是海洋生態(tài)系統(tǒng)主要的組成部分之一[1]。上世紀(jì)80年代，LEE和LANFER[2]首次發(fā)表了鯊魚軟骨含有抗腫瘤血管增生成分的研究論文，后來陸續(xù)從鯊魚軟骨中分離得到了多種抗腫瘤活性成分[3]。目前研究表明，軟骨魚軟骨的抗腫瘤活性成分主要包括以下三類：（1）多糖：新生血管生成抑制因子、腫瘤細(xì)胞抑制因子和免疫調(diào)節(jié)因子；（2）低分子量蛋白：新生血管生成抑制因子和免疫調(diào)節(jié)因子；（3）蛋白多糖：新生血管生成抑制因子。本文對(duì)軟骨魚類抗腫瘤活性成分的研究進(jìn)行綜述，為其后續(xù)開發(fā)提供可借鑒的依據(jù)。

1 海洋軟骨魚軟骨多糖

1.1 軟骨多糖新生血管生成抑制因子

1971年，F(xiàn)OLKMAN[4]提出腫瘤生長(zhǎng)依賴于血管的學(xué)說，后來根據(jù)腫瘤血管的生長(zhǎng)和分布狀況將腫瘤的生長(zhǎng)分為血管前期和血管期。在血管前期腫瘤細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，腫瘤生長(zhǎng)得到明顯抑制；而在血管期，腫瘤的新生血管生長(zhǎng)活躍，依靠豐富毛細(xì)血管網(wǎng)提供活躍代謝環(huán)境，腫瘤得以快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。如能抑制新生血管生長(zhǎng)，則可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，以腫瘤血管為靶點(diǎn)的研究是目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

軟骨是一種無(wú)血管組織，因?qū)δ[瘤侵噬具有一定的抵抗性而能夠抑制新生血管的生長(zhǎng)[5]。軟骨多糖屬于糖胺聚糖，是生物體內(nèi)分布廣泛的重要生理活性物質(zhì)。朱丹等研究表明魟魚軟骨多糖對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管形成具有顯著的抑制作用，其可能通過抑制腫瘤血管形成，發(fā)揮良好的抗腫瘤活性。姜華茂等[6]發(fā)現(xiàn)赤魟Dasyatis akajei軟骨多糖膀胱灌注可抑制大鼠原位膀胱腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與抑制腫瘤血管生長(zhǎng)有關(guān)。周莉莉等[7]研究結(jié)果顯示，鯊魚軟骨多糖可以有效的抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HUEVC）的生長(zhǎng)，其抑制率達(dá)到（45.615±0.084）%，并能有效的抑制雞胚絨毛尿囊膜的新生血管形成，（PBS對(duì)照組血管數(shù)目為18.750根，鯊魚軟骨多糖試驗(yàn)組血管數(shù)目為7.750±1.545根，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05）；結(jié)果提示鯊魚軟骨多糖在抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)與新生血管生成方面發(fā)揮著重要作用。郭斌等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，赤魟軟骨多糖體外能顯著抑制血管形成，作用機(jī)制可能在于下調(diào)VEGF、b-FGF、MMP-9基因和蛋白表達(dá)，體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制可能是阻斷小鼠Lewis肺癌移植瘤模型細(xì)胞的細(xì)胞周期。

以上研究發(fā)現(xiàn)，軟骨魚軟骨多糖對(duì)腫瘤血管的形成具有顯著的抑制作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1.2 軟骨多糖腫瘤細(xì)胞抑制因子

近年來，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)軟骨魚軟骨多糖除了含有血管生成抑制因子，同時(shí)含有腫瘤細(xì)胞抑制因子。腫瘤細(xì)胞抑制因子能夠以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形式清除癌細(xì)胞，從而直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

郭斌等[8]從黃點(diǎn)魟Dasyatis gerrardi軟骨中提取的粘多糖成分對(duì)人T淋巴細(xì)胞白血?。–EM）細(xì)胞的群體增殖有明顯的抑制作用，對(duì)小鼠足墊部移植瘤生長(zhǎng)抑制作用顯著。郭斌和朱丹等研究發(fā)現(xiàn)赤魟軟骨素對(duì)荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和CEM細(xì)胞株群體的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，且能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)CEM細(xì)胞表面標(biāo)志CD2，HLA-I分子的表達(dá)。病理學(xué)可見，應(yīng)用低劑量組赤魟軟骨多糖的小鼠S-180腫瘤細(xì)胞異型性不明顯。由此推斷，魟魚軟骨多糖具有一定的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用。

馮艷紅等[9]將赤魟軟骨多糖（RCG）應(yīng)用于膀胱癌EJ細(xì)胞研究，發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量依賴性，可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

1.3 軟骨多糖免疫調(diào)節(jié)因子

軟骨多糖類化合物的抗腫瘤作用，主要在于它能提高宿主的免疫功能，增加免疫細(xì)胞的活性。鯊魚軟骨中含有豐富的胺基糖、粘多糖和溶菌酶。胺基糖和粘多糖可以激活免疫系統(tǒng)，活化T、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攻擊癌細(xì)胞的能力，提高機(jī)體免疫能力，彌補(bǔ)化療、放療后因機(jī)體的免疫力低下而造成的抵抗力不足。

朱丹等研究表明赤魟軟骨多糖能顯著提高荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)（P<0.01）；能激活并增強(qiáng)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能；增強(qiáng)荷瘤小鼠脾細(xì)胞IL-2及腹腔巨噬細(xì)胞IL-1和TNF產(chǎn)生能力（P<0.05），赤魟軟骨多糖對(duì)荷瘤小鼠具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。欒潔等關(guān)于鯊魚軟骨粘多糖可以激活免疫系統(tǒng)的研究也表明了上述觀點(diǎn)。

綜上，軟骨魚多糖抗腫瘤活性物質(zhì)主要包括新生血管生成抑制因子、腫瘤抑制因子和免疫因子。其中，國(guó)內(nèi)外對(duì)新生血管生成抑制因子研究地比較深入，它主要是抑制腫瘤細(xì)胞一些酶的活性或一些血管刺激因子而阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用。軟骨多糖直接來源于動(dòng)物組織，無(wú)明顯的毒副作用，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)又顯示其具有良好的抗癌活性，有可能成為很有前途的抗癌新藥，但其抗癌效果及作用機(jī)制則需要進(jìn)行更加深入的探討。

2 海洋軟骨魚軟骨低分子量蛋白

2.1 軟骨蛋白新生血管生成抑制因子

近年來，隨著抗血管增生療法研究的深入，抑制新生血管生成的研究可能成為未來腫瘤治療的突破口，因此吸引了國(guó)內(nèi)外許多科學(xué)家從事該領(lǐng)域的工作。Folkman實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了兩種重組蛋白“endostatin”和“angiostatin”，具有非常明顯抑制血管生成及腫瘤生長(zhǎng)的作用，在國(guó)際上引起了轟動(dòng)[10]。

OIKAWA等[11]從日本鯊魚軟骨中提取得到血管生成抑制因子的相對(duì)分子質(zhì)量在1 000～10 000之間。能夠抑制哺乳動(dòng)物膠原酶、蛋白激酶和胰蛋白酶等的活性，抑制毛細(xì)血管上皮細(xì)胞的增生和遷移，從而有效地阻止已著床的腫瘤細(xì)胞建立新生血管網(wǎng)。尚俊英等[12]從廣西北海鯊魚軟骨中得到的小于100kDa低分子蛋白，結(jié)果顯示該低分子蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為（36.77±2.98）%，黏附抑制率為（52.95±4.48）%，遷移運(yùn)動(dòng)抑制率為（68.05±4.04）%，可顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜的新生血管的形成。

我國(guó)臺(tái)灣學(xué)者SHEU等[13]從藍(lán)鯊Prionace glauca軟骨中分離純化得到了2條相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa和14 kDa的新血管生成抑制因子U-995，可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，并會(huì)引起新血管的中斷和破裂，阻止破壞由腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成，防止由膠原酶誘導(dǎo)的膠原溶解。

2000-2001 年，沈先榮等[14]從我國(guó)沿海鯨鯊Rhincodon typus軟骨中提取分離了2種高度純化的血管生成抑制因子SCAIF1和SCAIF80，它們的相對(duì)分子量分別為18 kDa和8 kDa，并證實(shí)為2種新的活性蛋白質(zhì)。兩因子不僅能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖和運(yùn)動(dòng)遷移，還能顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜的血管生成，顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，且沒有顯示任何毒性，具有較好的新藥開發(fā)前景。

陳建鶴等[15]采用鹽酸胍抽提法從中國(guó)姥鯊Cetorhinus maximus軟骨組織得到相對(duì)分子質(zhì)量為8.3 kDa的蛋白質(zhì)，對(duì)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和體內(nèi)新生血管生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制活性，并能顯著抑制小鼠移植S180肉瘤的生長(zhǎng)。2003年曾鋒等[16]從廣東陽(yáng)江鯊魚軟骨中純化獲得分子量為17 400的鯊魚軟骨血管生成抑制因子（SCAI-c），對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管的形成具有顯著抑制效應(yīng)。

羅紅宇等[17]從赤魟軟骨中獲得高純度的血管生成抑制因子（DCAIF-I）對(duì)雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成具有明顯的抑制效果，并具有一定的量效關(guān)系。SDS-PAGE-考馬斯亮藍(lán)染色顯示為一條帶,分子量為62 kDa。

鄭蘭紅應(yīng)用鹽酸胍抽提、丙酮分級(jí)沉淀、超濾、凝膠層析等分離技術(shù)，從青鯊Prionace glauca軟骨中分離純化并鑒定了一種新的血管生成抑制因子。經(jīng)SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析顯示，分子量為15.5 kDa，采用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明這是一種新發(fā)現(xiàn)的鯊魚軟骨蛋白。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)毒或低毒的PG155是一個(gè)具有顯著的抗新生血管生成蛋白，提示其可能開發(fā)成為一個(gè)新型的抗腫瘤藥物。

上述研究表明軟骨魚軟骨蛋白的血管生成抑制因子主要是通過抑制膠原酶、蛋白酶和胰蛋白酶等的活性，阻止血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而有效阻止已著床的瘤細(xì)胞建立新生血管網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源的目的，使之保持在無(wú)血管靜止?fàn)顟B(tài)。此外抗血管增生活性物質(zhì)一般不會(huì)引起耐藥性[18]。ROBERT等[19]認(rèn)為血管生成抑制劑是無(wú)抗性的抗腫瘤藥，因?yàn)槠渥饔糜谀[瘤的重要靶區(qū)為遺傳性相當(dāng)穩(wěn)定的血管內(nèi)皮細(xì)胞。同時(shí)近年來許多學(xué)者和研究人員把目光轉(zhuǎn)移至鯊魚軟骨血管抑制因子，包括anti-MMPs[20]、anti-VEGF[21]、細(xì)胞凋亡因子[22]和TPA等[23]，它們通過拮抗內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等綜合作用抑制新生血管的形成。

由于不同的研究者采用不同的分離提取方法，使蛋白降解程度不同，進(jìn)而得到了分子質(zhì)量各異的具有血管生成抑制活性的降解物。如Luer[24]發(fā)現(xiàn)鯊軟骨的蛋白質(zhì)提取物中有6～7種蛋白質(zhì)能抑制腫瘤血管生長(zhǎng)，而Folkman認(rèn)為鯊魚軟骨中有13種活性蛋白質(zhì)能抑制腫瘤血管生長(zhǎng)。因此學(xué)術(shù)界對(duì)此項(xiàng)研究尚未有固定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 海洋軟骨低分子量蛋白免疫調(diào)節(jié)因子

我國(guó)古代就有中藥典籍記載鯊魚軟骨有提高人體免疫力的作用。王勁等[25]根據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)鯊魚藥用功效的記載，結(jié)合現(xiàn)代對(duì)鯊魚軟骨的認(rèn)識(shí)，探討了鯊魚軟骨抗癌增效及調(diào)節(jié)免疫功能的作用。結(jié)果表明，鯊魚軟骨可明顯提高荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性并增強(qiáng)其M動(dòng)細(xì)胞的吞噬能力，其與化療藥物（CTX、SFU、ADM）合用可提高抗腫瘤作用，證實(shí)鯊魚軟骨具有較好的扶正（提高免疫功能）作用和明顯的抗癌增效作用。

1964年，SAVA等[26]應(yīng)用溶菌酶治療10例晚期癌癥患者取得了一定的治療效果。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，溶菌酶的抗腫瘤活性是通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能這一途徑實(shí)現(xiàn)的，其在體內(nèi)可以象單核因子和淋巴因子那樣，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[27]。陳建鶴[28]等從中國(guó)姥鯊軟骨組織獲得介導(dǎo)溶菌酶活性的高純度蛋白質(zhì)（Sp15，分子量15.2 kDa），并首次完成了N-末端22個(gè)氨基酸殘基序列的測(cè)定；該研究也首次表明，鯊魚軟骨組織的抗腫瘤作用不僅僅是由新生血管抑制因子所介導(dǎo)，軟骨源溶菌酶樣分子（Sp15）至少亦參與介導(dǎo)了部分的抗腫瘤活性。同時(shí)Sp15具有極強(qiáng)的抑制體外血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。以往的溶菌酶抗腫瘤研究都局限于雞蛋清源溶菌酶，該研究為抗腫瘤研究開辟了新的道路。

HASSAN等[29]從角鯊Heterodontus Francisci中分離純化得到了分子量為14 kDa和15 kDa兩種蛋白質(zhì)的一個(gè)低分子量組分，該組分具有大多數(shù)免疫激活效應(yīng)，能夠增強(qiáng)免疫系統(tǒng)反應(yīng)，活化NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞以增強(qiáng)攻擊癌細(xì)胞的能力，并能抑制新生血管生成。海洋軟骨魚軟骨蛋白的免疫調(diào)節(jié)因子主要是一類小分子蛋白。據(jù)報(bào)道，溶菌酶分子可作為一種較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)因子而用于預(yù)防和治療惡性腫瘤。與此同時(shí)，國(guó)內(nèi)對(duì)海洋軟骨魚軟骨蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用研究并不多，需要進(jìn)行更加詳細(xì)深入的研究。

3 海洋軟骨抗腫瘤蛋白多糖類

科學(xué)家認(rèn)為，由于不同的研究者采用不同的分離提取方法，使蛋白多糖大分子的降解程度不同，進(jìn)而得到了分子質(zhì)量各異的具有血管生成抑制活性的降解物[30]。

王路等[31]從姥鯊軟骨中提取分離到了一種堿性的親水性糖蛋白（含糖量8%），對(duì)膠原酶、內(nèi)皮細(xì)胞DNA合成和血管生成均有明顯抑制作用，但對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)直接的殺傷和抑制作用。由于其抑制膠原酶的活性屬競(jìng)爭(zhēng)性抑制，因此推測(cè)其結(jié)構(gòu)可能與膠原酶相似。2000年美國(guó)加州大學(xué)的LIANG和WONG[32]從長(zhǎng)尾鯊Thresher Sharks軟骨中分離純化得到血管生成抑制因子SCF2，SCF2是一種含有硫酸角質(zhì)素和多肽的熱穩(wěn)定性蛋白多糖，對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞具有特異的血管生成抑制活性。上述研究表明雖然海洋軟骨魚軟骨蛋白多糖的降解程度不同，但均能有效的抑制血管生成從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

4 展望

軟骨魚軟骨的抗腫瘤機(jī)制是多樣的，除了新生血管生成抑制因子、腫瘤細(xì)胞抑制因子和免疫調(diào)節(jié)因子外，還有抗入侵因子、調(diào)節(jié)前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用。其中對(duì)新生血管生成抑制因子、腫瘤細(xì)胞抑制因子和免疫調(diào)節(jié)因子的研究比較深入，而對(duì)抗入侵因子、調(diào)節(jié)前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用的研究還需要進(jìn)一步的探索。軟骨魚軟骨的毒副作用小且抗癌作用明顯，成為未來抗癌領(lǐng)域的有效藥物指日可待。

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