高效液相色譜法測定槲樹葉中槲皮素的含量

趙煥君 ，趙 琳 ，孫長晶 ，劉 威

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.吉林大峻藥業(yè)銷售部，遼寧 沈陽 110006）

槲樹（QuercusdentataThunb.）為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus L.）植物，作為民間中草藥被廣泛應(yīng)用，并且有著悠久的藥用歷史。據(jù)記載其主要用于治療痢疾、惡瘡等癥。有清熱解毒、安神利尿之功效，對血痢、血痔、淋病、尿赤有較好的醫(yī)療效果。《本草綱目》上記載“槲葉具有活血，利小便，除面上齄赤，孩子淋疾”?！冬F(xiàn)代實用中藥》、《中藥大辭典》,均有關(guān)于槲葉治療淋癥的記載。

槲皮素（quercetin）作為槲樹葉的主要有效成分之一，本文用高效液相色譜法對槲樹葉中的槲皮素進(jìn)行定量研究，為槲樹葉的質(zhì)量控制提供了實驗方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑、原料藥材

Agilent液相色譜儀；Agilent檢測器；安捷倫色譜工作站；KQ3200超聲波清洗器（江蘇昆山）。

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（C.P）；其他所用試劑均為分析純；槲樹葉（丹東東港，經(jīng)鑒定為槲樹（Quercus dentata Thunb.）的葉）。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取槲皮素對照品，加甲醇溶解，制成每1mL含0.00556mg槲皮素的溶液，作為對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥槲樹葉粉末2.0g，至具塞三角瓶中，精密加入乙醚20mL，超聲提取20min，棄去乙醚液，至藥渣無乙醚味，再精密加入甲醇25mL，稱重，超聲30min，放涼，稱重，用甲醇補(bǔ)足重量，然后用濾紙過濾，再用0.45μm的濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.3 測試條件 經(jīng)紫外掃描，檢測波長為365nm。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-水溶液（55∶45）；檢測波長為365nm。

2 測定結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

取槲皮素對照品溶液，分別精密吸取3、6、9、12、15μL，測定色譜峰面積，并以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1，得回歸方程：A=33.662C+19.526，R2=0.9997。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

由圖1可見，槲皮素在0.01668～0.08340μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 重復(fù)性實驗

取本品1.0g，共5份，精密稱定，制成供試品溶液。分別精密吸取10μL，測定槲皮素含量。RSD（%）為1.58。結(jié)果顯示，方法重復(fù)性良好。

2.3 精密度實驗

精密吸取同一供試品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定色譜峰面積。RSD（%）為0.896。結(jié)果顯示，5次測定的色譜峰面積無明顯變化，儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取槲樹葉1.0g，精密稱定，制成供試品溶液，精密吸取同一供試品溶液 10μL，分別于 0、2、4、6、8h進(jìn)樣分析，測定色譜峰面積，RSD（%）為1.85。結(jié)果表明，供試品溶液制備后，8h內(nèi)測定，樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知準(zhǔn)確含量的本品（含量0.01616mg·g-1）6份,每份0.5g。分別置25mL量瓶中，精密加入槲皮素對照品溶液（0.00556mg·mL-1）12.5mL，加甲醇稀釋至刻度。分別進(jìn)樣10μL。結(jié)果顯示，本方法槲皮素的回收率為97.9%，RSD（%）為1.46%。

2.6 含量測定

精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10μL注入高效液相色譜儀，依法測定，供試品溶液與對照品具有相同保留時間的色譜峰，結(jié)果見表1。經(jīng)計算槲樹葉中所含槲皮素的含量為0.028mg·g-1。

表1 HPLC含量測定結(jié)果Tab.1 Determination results of content by HPLC

3 討論

（1）試選用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液等為流動相，結(jié)果以前者為流動相，比例為55∶45時槲皮素的峰型最好，與其相鄰組分分離度都可達(dá)到要求。

（2）比較了多種提取方式，如超聲提取，但樣品粘稠很難過濾，不如用甲醇回流提取可行。

（3）比較了365nm和280nm的檢測波長，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素在365nm處吸收較好。并且與其他成分有較好的分離，干擾少，故選擇365nm處作為吸收波長。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC法，測定槲樹葉中槲皮素的含量，方法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，回收率滿意，操作簡單可行，對于槲樹葉藥材的鑒別及質(zhì)量評價具有重要意義，并對該藥材的進(jìn)一步研究、開發(fā)、利用和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

［1］賈曉斌，劉光敏，封亮，等.HPLC測定夏枯草中的蘆丁和槲皮素［J］.華西藥學(xué)雜志，2010，25（1）：70-71.

［2］蔡小玲，張可鋒.扛板歸中總黃酮和槲皮素的含量測定［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010,37（3）：511-512.