Lactacystin 誘導(dǎo)帕金森病大鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞的變化

莊文欣 付文玉 楊 麗

(濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心; 濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室山東261053)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種以運(yùn)動(dòng)功能障礙為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)異常,其主要病理特征是黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性及包涵體的(Lewy body,LB)形成。PD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,最近的研究結(jié)果表明:泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin proteasome system,UPS)功能下降、氧化應(yīng)激和腦內(nèi)炎癥可能在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性過程中起重要作用[1,2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的固有免疫細(xì)胞,神經(jīng)炎癥的主要參與者,通過多種途徑參與氧化應(yīng)激、炎癥等過程[3]。OX-42是小膠質(zhì)細(xì)胞表面補(bǔ)體Ⅲ型受體的抗體,可以作為其高特異性、高敏感性的標(biāo)志物。星形膠質(zhì)細(xì)胞約占大腦皮質(zhì)總細(xì)胞數(shù)的50%,為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)支持,參與突觸形成、神經(jīng)元的發(fā)育、神經(jīng)元的物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)和神經(jīng)信息調(diào)控。在病理情況下,星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖加速,合成并分泌多種免疫和炎癥介質(zhì),參與抗原提呈[4]。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是細(xì)胞骨架的中間細(xì)絲蛋白,特異表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞,或少量表達(dá)于其前體細(xì)胞。而核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)是炎癥反應(yīng)中重要的炎性介質(zhì)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察蛋白酶體抑制劑Lactacystin抑制黑質(zhì)蛋白酶體功能后小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、NF-κB以及DA能神經(jīng)元的變化情況,為進(jìn)一步闡明其在PD的發(fā)病中的作用,為臨床治療PD新靶點(diǎn)的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

健康Spraque-Dawley(SD)大鼠30只,雌雄不限,體重200-250g,濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。蛋白酶體抑制劑Lactacystin(美國Cayman公司),阿樸嗎啡(apomorphine,APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)多克隆抗體均為美國Sigma公司產(chǎn)品,小鼠抗大鼠OX-42單克隆抗體(美國CHEMICON公司),兔抗大鼠 GFAP多克隆抗體、小鼠抗大鼠NF-κB抗體均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

2.動(dòng) 物分組及模型制備

SD大鼠30只,水合氯醛腹腔注射麻醉后,固定于腦立體定位儀上,在無菌條件下,正中切開大鼠顱頂部皮膚,剝離骨膜,暴露前囟(十字縫)、后囟(人字縫),并確保在同一水平位置。參照Louis.Pellegrino等大鼠腦立體定位圖譜,采用兩點(diǎn)注射法制備大鼠PD模型。選擇右側(cè)注射坐標(biāo)點(diǎn)為:(1)前囟后5.0mm,正中線右側(cè)2.0mm,硬膜下8.0mm;(2)前囟后4.4mm,正中線右側(cè)1.2mm,硬膜下8.0 mm鉆孔。用微量進(jìn)樣器將10μg Lactacystin(20μl)注射至右側(cè)黑質(zhì)致密部及中腦內(nèi)側(cè)束,每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)注射 Lactacystin10μl,注射速度為 1μl/min,注射完畢后留針10min,然后以1.0mm/min速度緩慢退針(約10min)。術(shù)畢,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口,放回籠中喂養(yǎng)。術(shù)后3周APO腹腔注射(0.25 mg/kg),觀察大鼠行為學(xué)變化,若恒定轉(zhuǎn)向損毀側(cè),且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>120r/30min,則視為成功 PD大鼠模型。另取6只正常大鼠作為對(duì)照組,各組均于8周后灌注取材。

3.組 織標(biāo)本的制備

動(dòng)物深度麻醉后,從一側(cè)頸總動(dòng)脈灌注生理鹽水50ml,后灌注4%多聚甲醛200ml。斷頭取腦,將腦組織浸入4%多聚甲醛中后固定過夜。一部分成功模型鼠的大腦組織經(jīng)脫水、包埋,常規(guī)石蠟切片,片厚6μm。另一部分成功模型鼠的大腦組織經(jīng)后固定后放入20%的蔗糖溶液中直至標(biāo)本沉底,然后將固定的中腦組織經(jīng)0.01mol/L PBS緩沖液沖洗后,行冠狀連續(xù)冰凍切片,片厚20μm,放入-20℃冰箱內(nèi)保存。取冰凍切片,采用SP法進(jìn)行OX-42及NF-κB免疫組化染色,步驟如下:3%H2O2孵育30min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,正常羊血清封閉,室溫,30min,傾去多余血清,分別滴加OX-42及NF-κB,4℃,過夜,滴加生物素化二抗,37℃,30 min,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素,37℃,30 min,DAB避光顯色,3-5min,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。各步驟之間以0.01mol/L PBS沖洗。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。陽性細(xì)胞胞質(zhì)均染為棕色。對(duì)照組結(jié)果為陰性。取石蠟切片行 TH和GFAP免疫熒光染色。

4.結(jié) 果分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

黑質(zhì) TH、OX-42及 GFAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù):各組大鼠選取6張以上切片,計(jì)數(shù)每張切片上注射側(cè)和健側(cè)陽性細(xì)胞總數(shù)。分別計(jì)數(shù)注射側(cè)及健側(cè)TH、GFAP、OX-42陽性細(xì)胞數(shù) ,并以 Lactacysin注射側(cè)陽性細(xì)胞總數(shù)/健側(cè)陽性細(xì)胞總數(shù)×100%表示陽性表達(dá)的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,使用SPSS13.0 for windows軟件統(tǒng)計(jì),進(jìn)行計(jì)量資料的單因素方差分析。各組數(shù)據(jù)均以 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01認(rèn)為有顯著性差異。

黑質(zhì)NF-κB的表達(dá):每只大鼠選取黑質(zhì)致密部,可見 TH陽性細(xì)胞的相鄰切片5張,應(yīng)用 Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件,分析各組大鼠雙側(cè)黑質(zhì)NF-κB的積分光密度(IOD)值。并以注射側(cè)IOD值/健側(cè)IOD值×100%表示陽性表達(dá)的變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示,使用SPSS13.0 for windows軟件統(tǒng)計(jì),進(jìn)行計(jì)量資料的單因素方差分析。各組數(shù)據(jù)均以 P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01認(rèn)為有顯著性差異。

結(jié) 果

1.大 鼠行為學(xué)檢測(cè)

對(duì)照組大鼠活動(dòng)自如,注射APO后未出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠1周時(shí)出現(xiàn)活動(dòng)減少,對(duì)外界刺激無自主豎毛,逃避反應(yīng)慢,3周時(shí)腹腔注射APO檢測(cè)大鼠行為,實(shí)驗(yàn)組8只大鼠向損毀側(cè)連續(xù)旋轉(zhuǎn),平均 129圈/30min,并出現(xiàn)嗅探、震顫、后肢撓抓、嘶咬異物、煩躁不安及激惹等現(xiàn)象,8周時(shí)同方法檢測(cè)有11只大鼠向損毀側(cè)連續(xù)旋轉(zhuǎn),平均216圈/30min。注射APO后大鼠出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn),旋轉(zhuǎn)時(shí)身體側(cè)曲成環(huán)狀,頭尾銜接,以健側(cè)后肢為支點(diǎn)旋轉(zhuǎn)。大鼠平均轉(zhuǎn)速>5r/min,視為成功PD模型。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較 P<0.05。

2.黑 質(zhì) TH的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組大鼠健側(cè)及對(duì)照組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)均可見大量密集的 TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元,胞體較大,呈梭形或橢圓形,胞漿著色(圖2),實(shí)驗(yàn)組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)量較健側(cè)顯著減少(圖3)。實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)與健側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)之比與對(duì)照組雙側(cè)黑質(zhì) TH陽性細(xì)胞數(shù)之比的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖 1)。

3.黑 質(zhì) GFAP的表達(dá)

對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組健側(cè) GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量較少,胞體呈星形,染色淺(圖4),兩模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì) GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加,突起變短,染色加深(圖5)。實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)與健側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)之比與對(duì)照組雙側(cè)黑質(zhì) GFAP陽性細(xì)胞數(shù)之比差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

4.黑 質(zhì)OX-42的表達(dá)

對(duì)照組大鼠和實(shí)驗(yàn)組大鼠健側(cè)黑質(zhì)OX-42陽性細(xì)胞呈典型的“分枝狀”,突起較長(zhǎng),胞體較小(圖6);實(shí)驗(yàn)組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,胞體增大,突起變短,增粗,呈現(xiàn)典型的"阿米巴狀"(圖7)。實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)與健側(cè)OX-42陽性細(xì)胞數(shù)之比與對(duì)照組雙側(cè)陽性細(xì)胞數(shù)之比有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 各組大鼠損毀側(cè)與健側(cè)黑質(zhì) TH、GFAP及OX-42陽性細(xì)胞數(shù)百分比之比較(損毀側(cè)/健側(cè)×100%)Fig.1 Comparison of the percentage of TH,GFAP and OX-42 positive cell in each group between the injected side and the normal side in the substantia nigra of the rats(injected side/normal side×100%)

5.黑 質(zhì)NF-κB的表達(dá)

對(duì)照組大鼠黑質(zhì)NF-κB的表達(dá)量較少,陽性細(xì)胞分布較稀疏,染色較淺(圖8);實(shí)驗(yàn)組大鼠損毀側(cè)NF-κB表達(dá)量明顯增多,陽性細(xì)胞分布較密集,染色加深(圖9)。實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)與健側(cè)的IOD值的百分比(156.362±4.22)與對(duì)照組 IOD值的百分比(84.139±2.868)相比較差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

泛素-蛋白酶體途徑是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一,存在于所有的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,負(fù)責(zé)清除細(xì)胞內(nèi)突變、損傷和異常折疊的蛋白質(zhì),其功能異?；蛩ソ邔?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異常蛋白蓄積、細(xì)胞功能障礙,甚至細(xì)胞死亡[6]。蛋白酶體抑制劑Lactacystin是鏈霉菌的一種代謝物,是選擇性的20S蛋白酶抑制劑,它及其活性中間體的β-內(nèi)酯(1actone)可選擇性和不可逆地結(jié)合于蛋白酶體的β5亞單位,從而抑制蛋白酶體多種肽酶的活性[7],最終導(dǎo)致UPS功能異常。最近的研究發(fā)現(xiàn)UPS對(duì)蛋白降解能力的破壞是PD發(fā)病過程中的一個(gè)重要因素[8]。本實(shí)驗(yàn)中我們將蛋白酶體抑制劑Lactacystin 20μl定向注射到大鼠黑質(zhì)及中腦外側(cè)束,結(jié)果模型大鼠表現(xiàn)出典型的 PD行為學(xué)變化,旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的多少反映了黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)受損害的嚴(yán)重程度。免疫組化結(jié)果顯示損毀側(cè)黑質(zhì) TH陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少,提示DA能神經(jīng)元大量丟失。

近年來的研究表明,炎癥反應(yīng)在帕金森病中起著重要的作用[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞,它的活化在PD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在成熟的腦組織中,靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞呈特征性的分枝狀形態(tài),受到刺激后很容易被激活,形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯改變,從分枝狀變成阿米巴樣[10]。在 MPTP 小 鼠 PD 模 型、脂 多 糖(1ipopolysaccharide,LPS)模型[11]、魚藤酮 (Rotenone)模型、6-OHDA大鼠 PD模型[12]中均能觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損或炎癥時(shí),亦從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變,細(xì)胞數(shù)目明顯增加,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)和毒性雙重作用[13]。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察了由Lactacystin所致的 PD模型大鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、與DA能神經(jīng)元變性、缺失并存,小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,數(shù)量增多,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多,這與 Xie等[14]的研究結(jié)果基本一致,由此進(jìn)一步證實(shí)了在PD發(fā)病過程中膠質(zhì)細(xì)胞激活持續(xù)存在并與DA能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失有關(guān)。

NF-κB存在于神經(jīng)系統(tǒng)幾乎所有類型的細(xì)胞中,主要包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突細(xì)胞,在神經(jīng)塑型、神經(jīng)發(fā)育及神經(jīng)變性等過程中具有獨(dú)特作用。它的激活與PD的病理機(jī)制有關(guān)。王茜等[15]研究了由 MPTP制備的PD小鼠 NF-κB對(duì) COX-2表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn) PD組NF-κB表達(dá)明顯升高。為研究由Lactacystin所誘導(dǎo)的 PD發(fā)病中NF-κB的表達(dá)以及與DA能神經(jīng)元變性丟失的關(guān)系,我們觀察了其在中腦黑質(zhì)區(qū)的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組黑質(zhì) TH陽性細(xì)胞數(shù)減少,炎性介質(zhì) NF-κB表達(dá)量明顯增高(P<0.01)。

總之,在本實(shí)驗(yàn)中我們利用蛋白酶體抑制劑Lactacystin腦內(nèi)立體定位注射法制備大鼠偏側(cè)PD模型,觀察到實(shí)驗(yàn)組健側(cè)致密部?jī)?nèi)DA能神經(jīng)元數(shù)量較多,而注射側(cè)除了DA能神經(jīng)元數(shù)量減少外,還伴有小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯著增生。激活了的小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞,引發(fā)的炎癥反應(yīng)促使炎性介質(zhì)NF-κB表達(dá)增強(qiáng),引發(fā)DA能神經(jīng)元的凋亡,而后者又能反過來進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞,這樣一種循環(huán)連鎖反應(yīng)可能被認(rèn)為是致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為以膠質(zhì)細(xì)胞、NF-κB作為靶點(diǎn)治療 PD提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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圖 版 說 明

圖2 對(duì)照組TH陽性細(xì)胞。免疫熒光 ×400

圖3 實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞。免疫熒光 ×400

圖4 對(duì)照組 GFAP陽性細(xì)胞。免疫熒光 ×400

圖5 實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè) GFAP陽性細(xì)胞。免疫熒光 ×400

圖6 對(duì)照組OX-42陽性細(xì)胞。免疫組織染色 ×400

圖7 實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)OX-42陽性細(xì)胞。免疫組織染色 ×400

圖8 對(duì)照組NF-κB陽性細(xì)胞。免疫組織染色 ×400

圖9 實(shí)驗(yàn)組損毀側(cè)NF-κB陽性細(xì)胞。免疫組織染色 ×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.2 TH-positive cells in the control group.Immunofluorescence×400

Fig 3 TH-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunofluorescence×400

Fig 4 GFAP-positive cells in the control group.Immunofluorescence×400

Fig 5 GFAP-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunofluorescence×400

Fig 6 OX-42-positive cells in the control group.Immunohistochemistry×400

Fig 7 OX-42-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunohistochemistry×400

Fig 8 NF-κB-positive cells in the control group.Immunohistochemistry×400

Fig 9 NF-κB-positive cells in the Lactacystin injected sides of the model group.Immunohistochemistry×400