中間絲蛋白Nestin在不同病程糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)

劉 巍 段惠軍＊ 張 悅 張 怡 郝 軍

(1河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室; 2河北醫(yī)科大學(xué)臨床診斷學(xué)教研室,石家莊050017;3河北省保定市傳染病醫(yī)院,保定070000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常見的慢性并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因。蛋白尿是DN重要的臨床表現(xiàn),與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成之一,其結(jié)構(gòu)與功能的改變,在DN的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。Nestin(巢蛋白)屬于第Ⅵ類中間絲蛋白,表達(dá)于多種組織的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中,被廣泛用作干細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白之一。Nestin的功能與維持前體細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān),也可與其他中間絲蛋白共聚組裝成中間絲發(fā)揮細(xì)胞骨架作用。最近研究發(fā)現(xiàn),在腎臟已分化成熟的足細(xì)胞中有大量Nestin的表達(dá),并且對(duì)維持足細(xì)胞的正常形態(tài)起重要作用[1-2]。實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)Nestin在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá),探討其在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

材料和方法

1.主 要試劑

鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(Sigma公司);Nestin鼠單克隆抗體(Santa Cruz公司);二步法抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(Gene Tech公司);FITC標(biāo)記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

2.動(dòng) 物模型及分組

清潔級(jí)雄性 Wistar大鼠,體質(zhì)量120-150g(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。STZ按65 mg/kg腹腔注射,溶劑為0.01mol/L的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(p H=4.5),48 h后測(cè)空腹血糖,血糖≥16.7mmol/L且尿糖陽(yáng)性者作為糖尿病(Diabetes mellitus,DM)大鼠。隨機(jī)分成 DM 2、4、8、12 和 16周組,每一時(shí)間點(diǎn)均設(shè)鼠齡匹配的正常對(duì)照組(n=5),對(duì)照組腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均自由飲食,不使用胰島素或其他降糖藥物。

3.動(dòng) 物標(biāo)本的留取

DM大鼠成模后,每周測(cè)血糖1次,不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠棄去。分別于成模第2、4、8、12和16周時(shí)處死各組DM大鼠及對(duì)照的正常組大鼠。處死前1d對(duì)大鼠稱重,代謝籠收集24h尿液,記錄尿量。禁食6-8h,麻醉后稱重,股動(dòng)脈放血收集血液,4℃離心,分離血清,用于生化指標(biāo)檢測(cè);開腹取雙側(cè)腎臟,稱重,測(cè)定腎重/體重(mg·g-1);一側(cè)腎臟固定于4%多聚甲醛供制作石蠟切片用,另一側(cè)腎臟取皮質(zhì),部分置于70%乙醇固定后行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),其余部分于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.生 化指標(biāo)測(cè)定

采用日立7170-A全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè) Glu、BUN、尿蛋白。以腎重(mg)與體重(g)比值作為腎臟指數(shù)(Kidney Index,KI)。

5.常 規(guī)病理學(xué)觀察

腎組織石蠟包埋后切片2μm,常規(guī) HE染色,光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

6.免 疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nestin表達(dá)

石蠟包埋腎組織4μm切片,脫蠟至水,應(yīng)用二步法免疫組化試劑盒檢測(cè)Nestin表達(dá),陰性對(duì)照用PBS代替一抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。每張切片隨即找出10-15個(gè)腎小球,經(jīng) Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,分別得出每個(gè)腎小球中Nestin表達(dá)的積分光密度值(IOD),所有腎小球取平均值為該標(biāo)本的Nestin陽(yáng)性表達(dá)值。

7.流 式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nestin表達(dá)

將標(biāo)本用網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液,采用間接免疫熒光法,在細(xì)胞懸液中加入1∶100稀釋的鼠抗Nestin單克隆抗體,37℃溫浴30min后生理鹽水洗滌,加入羊抗鼠 FITC-IgG,溫浴洗滌后行流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司,Epics-XLⅡ型)檢測(cè),測(cè)量的數(shù)據(jù)應(yīng)用相應(yīng)的程序進(jìn)行資料處理,測(cè)定前以標(biāo)準(zhǔn)樣品調(diào)整儀器CV值在2%以內(nèi)。Nestin表達(dá)的定量分析以熒光指數(shù)(FI)表示其相對(duì)含量:FI=(樣品的平均熒光強(qiáng)度-對(duì)照樣品平均熒光強(qiáng)度)/對(duì)照組組織平均熒光強(qiáng)度。

8.統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間均數(shù)比較采用 t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.一 般情況

與正常對(duì)照組相比,DM組大鼠血糖明顯升高,出現(xiàn)多飲、多食、多尿、毛色晦暗等癥狀,體重下降明顯。

2.腎 臟指數(shù)(Kidney Index,KI)及血尿生化指標(biāo)的改變

與同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組相比,DM組大鼠 KI值均出現(xiàn)明顯升高,并且在第8周時(shí)達(dá)高峰,而后略下降。與對(duì)照組相比,DM組大鼠血糖、血尿素氮和24 h尿蛋白量從第2周起均出現(xiàn)明顯升高(P<0.05或 P<0.01),且隨病程進(jìn)展升高程度加重(表1)。

表1 對(duì)照組和糖尿病組腎臟指數(shù)、血糖、血尿素氮和24 h尿蛋白量(ˉx±s)Table 1 Kidney index,blood glucose,blood urea nitrogen and 24 h urinary protein in control groups and diabetic groups(ˉx ±s)

3.腎 組織病理學(xué)改變

光鏡下各對(duì)照組大鼠腎組織均未見病理改變。DM組大鼠從第2周起出現(xiàn)腎小球體積增大,系膜細(xì)胞輕度增生;至8周時(shí)系膜基質(zhì)明顯增多,系膜區(qū)增寬;12、16周時(shí)腎小球呈分葉狀,腎小管上皮細(xì)胞可見明顯空泡變性及壞死(圖1)。

4.免 疫組化檢測(cè)Nestin的表達(dá)

Nestin在腎臟主要表達(dá)于腎小球基底膜外側(cè)足細(xì)胞胞漿中,在正常對(duì)照組中呈點(diǎn)狀或線狀分布。DM組Nestin表達(dá)水平從第2周起即出現(xiàn)升高,呈粗顆粒狀分布在足細(xì)胞胞漿中;第8周時(shí)Nestin呈團(tuán)塊狀分布,表達(dá)達(dá)高峰;12周以后,Nestin表達(dá)開始下降(圖2)。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析,結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,DM組從第4周起Nestin表達(dá)的積分光密度值顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且在第8周時(shí)達(dá)高峰(表2)。

表2 Nestin表達(dá)的積分光密度值(IOD)(ˉx±s)Table 2 IOD of Nestin in different groups(ˉx ±s)

5.流 式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nestin的表達(dá)

與對(duì)照組相比,DM各組Nestin表達(dá)均升高,第8周時(shí)達(dá)到高峰,而后降低(表3)。

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nestin的表達(dá)(FI,ˉx±s)Table 3 The expression of Nestin protein assessed by flow cytometry(FI,ˉx ±s)

圖1 HE染色檢測(cè)腎組織病理學(xué)變化(×400)。A:對(duì)照組;B:2周組;C:4周組;D:8周組;E:12周組;F:16周組Fig.1 HE staining of renal tissue in different groups(×400).A:Control group;B:2 weeks;C:4 weeks;D:8 weeks;E:12 weeks;F:16 weeks

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Nestin的表達(dá)(×400)。A:對(duì)照組;B:2周組;C:4周組;D:8周組;E:12周組;F:16周組Fig.2 Immunohistochemical staining of Nestin(×400).A:Control group;B:2 weeks;C:4 weeks;D:8 weeks;E:12 weeks;F:16 weeks

討 論

糖尿病腎病是影響糖尿病患者生存質(zhì)量的嚴(yán)重并發(fā)癥,以往研究多集中于系膜區(qū)的擴(kuò)張及基底膜的增厚。但最近的研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞的損傷在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,是腎小球硬化和慢性腎臟病進(jìn)展的重要機(jī)制[3]。

足細(xì)胞是一種具有復(fù)雜細(xì)胞骨架系統(tǒng)的高度分化的上皮細(xì)胞,它最主要的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)是其呈指狀連接的足突[4],這些足突由裂孔膜連接,是腎小球?yàn)V過膜的最后一道屏障,決定了腎小球選擇性濾過的蛋白分子的大小,任何原因引起的足突損傷都可引起蛋白尿,影響腎臟功能[5]。因此,正常而完整的細(xì)胞骨架系統(tǒng)是維持足突形態(tài)和功能的重要保證。

Nestin(巢蛋白)是一種屬于中間絲的細(xì)胞骨架蛋白,首先被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于胚胎神經(jīng)干細(xì)胞[6]。隨后的研究發(fā)現(xiàn),在多種組織如肌肉、胰島、皮膚等的干細(xì)胞或前體細(xì)胞中也有Nestin的表達(dá),因此被廣泛用作干細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白[7]。最近研究發(fā)現(xiàn),在腎小球中也有Nestin的表達(dá)。在發(fā)育成熟的腎小球中,Nestin主要表達(dá)在分化成熟的足細(xì)胞的胞漿及初級(jí)足突中,而在腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞中沒有表達(dá)[8]。

Nestin對(duì)維持足細(xì)胞正常的形態(tài)和功能具有重要的作用。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制小鼠足細(xì)胞中Nestin的表達(dá)會(huì)使足細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞的足突會(huì)變短或消失[9]。Zou等[10]采用嘌呤霉素Wistar大鼠腎病模型發(fā)現(xiàn),病變進(jìn)展至高峰期時(shí),足細(xì)胞中Nestin、Vimentin和Desmin等三種中間絲蛋白的表達(dá)均有增加的趨勢(shì),推測(cè)這種表達(dá)的增加與足細(xì)胞的肥大有關(guān),中間絲蛋白的表達(dá)上調(diào)可以增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,使足細(xì)胞承受腎小球毛細(xì)血管壁高壓力的變化。尤莉等[11]采用相同的腎病模型發(fā)現(xiàn),PAN注射后,腎小球中Nestin的表達(dá)在初期有一過性增高,隨即下降,同時(shí)足細(xì)胞的足突出現(xiàn)廣泛融合,并伴有大量的蛋白尿,推測(cè)Nestin參與了蛋白尿的發(fā)生及足突的融合。

實(shí)驗(yàn)采用STZ腹腔注射復(fù)制Ⅰ型糖尿病大鼠模型,觀察糖尿病腎損傷后Nestin的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),成模后2周,糖尿病大鼠腎小球體積增大,24 h尿蛋白量開始增多。免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,Nestin表達(dá)在成模后2周開始增多,并隨病程進(jìn)展逐漸升高,第8周時(shí)其程度達(dá)高峰,而后略有下降。我們推測(cè)該變化可能是由于糖尿病時(shí)腎小球?yàn)V過率增高,足細(xì)胞通過代償性肥大和細(xì)胞骨架的改變,以對(duì)抗增高的毛細(xì)血管內(nèi)壓力,維持細(xì)胞穩(wěn)定。但是,當(dāng)足細(xì)胞損傷加重,代償機(jī)制逐漸失效時(shí),Nestin的表達(dá)則開始出現(xiàn)下調(diào)。

關(guān)于Nestin的蛋白結(jié)構(gòu),與其他類別的中間絲蛋白不同,其N端較短,不能獨(dú)立形成同源二聚體,必需和其他中間絲分子一起形成異源二聚體,而其C端較長(zhǎng),使其可以連接其他中間絲的同源二聚體。這些特征使Nestin成為連接細(xì)胞骨架蛋白的橋梁[12-13]。免疫共沉淀研究顯示,抗Nestin抗體不但可以沉淀Nestin,還可以沉淀其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白如Ⅲ類中間絲蛋白 vimentin、Ⅳ類中間絲蛋白α-internexin,提示Nestin可能通過與其他種類的中間絲蛋白結(jié)合,共同參與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的組裝和調(diào)節(jié)[14]。我們的研究推測(cè)Nestin表達(dá)變化可能與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷及病情的發(fā)展密切相關(guān),但其具體的作用機(jī)制及與其他類型中間絲蛋白的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

[1]Ishizaki M,Ishiwata T,Adachi A,et al.Expression of nestin in rat and human glomerular podocytes.J Submicrosc Cytol Pathol,2006,38(2-3):193-200

[2]Chen J,Boyle S,Zhao M,et al.Differential expression of the intermediate filament protein nestin during renal development and its localization in adult podocytes.J Am Soc Nephrol,2006,17(5):1283-1291

[3]Reiniger N,Lau K,McCalla D,et al.Deletion of the receptor for advanced glycation end products reduces glomerulosclerosis and preserves renal function in the diabetic OVE26 mouse.Diabetes,2010,59(8):2043-2054

[4]Hermann P,Wilhelm K,Matthias K.Cell biology of the glomerular podocyte.Physiol Rev,2003,83(1):253-307

[5]Holzman LB,St John PL,Kovari IA,et al.Nephrin localizes to the slit pore of the glomerular epithelial cell.Kidney Int,1999,56(4):1481-1491

[6]Lendahl U,Zimmerman LB,Mckay RDG,et al.CNS stem cells express a newclass of intermediate filament protein.Cell,1990,60(4):585-595

[7]Wiese C,Rolletschek A,Kania G,et al.Nestin expression-a property of multi-lineage progenitor cells?Cell Mol Life Sci,2004,61(19-20):2510-2522

[8]Bertelli E,Regoli M,Fonzi L,et al.Nestin expression in adult and developing human Kidney.J Histochem Cytochem,2007,55(4):411-421

[9]蘇蔚,房成,楊海春,等.巢蛋白對(duì)維持足細(xì)胞形態(tài)作用的探討.中國(guó)病理生理學(xué)雜志,2009,25(1):156-159

[10]Zou J,Yaoita E,Watanabe Y,et al.Upregulation of nestin,vimentin,and desmin in rat podocytes in response to injury.Virchows Arch,2006,448(4):485-492

[11]尤莉,陳靖,蘇蔚,等.巢蛋白在足突廣泛融合的腎小球中表達(dá)下調(diào)及與蛋白尿程度的相關(guān)性.中華腎臟病雜志,2008,24(6):405-410

[12]Herrmann H,Aebi U.Intermediate filaments and their associates:multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics.Curr Opin Cell Bio,2000,12(1):79-90

[13]Michalczyk K,Ziman M.Nestin structure and predicated function in cellular cytoskeletal organization.Histol Histopathol,2005,20(2):665-671

[14]Perry J,Ho M,Viero S,et al.The intermediate filament nestin is highly expressed in normal human podocytes and podocytes in glomerular disease.Pediatr Dev Patho,2007,10(5):369-382