非小細胞肺癌中血管生成擬態(tài)和VEGF的表達及意義

承澤農(nóng) 武世伍 俞 嵐 宋文慶 陶儀聲

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科,蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室 安徽 233003)

當(dāng)腫瘤直徑達到或超過1-2mm時,由環(huán)境滲透提供的營養(yǎng)物質(zhì)已不能保證腫瘤細胞的生長。此時,向腫瘤提供營養(yǎng)的血管逐步形成。長期以來,人們一直認為腫瘤血管生成是其獲得血液供應(yīng)的唯一途徑。直到1999年美國學(xué)者Maniotis發(fā)現(xiàn)人眼葡萄膜黑色素瘤中存在由腫瘤細胞圍成的管道結(jié)構(gòu)—血管生成擬態(tài)(Vasculogenic mimicry,VM),首次提出了一種與經(jīng)典腫瘤血管生成途徑不同的模式,VM概念的提出豐富了腫瘤血液供應(yīng)理論。VM的存在與疾病進展和預(yù)后不良相關(guān)[1-2]。VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子,其在腫瘤血管生成中有確切的重要作用。本研究通過檢測160例NSCLC病例標(biāo)本VM和VEGF的表達,探討VEGF與VM與NSCLC患者的預(yù)后關(guān)系及其與NSCLC浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

材料和方法

1. 一般資料

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2003年1月—2005年4月存檔石蠟包埋NSCLC組織標(biāo)本160例(術(shù)前未行放、化療)和正常肺組織標(biāo)本20例,所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料,入選病例隨訪至患者死亡或截止2010年4月,隨訪時間為3-84個月。其中男性130例,女性30例;從大體類型看,中央型120例,周圍型40例;鱗癌116例(高分化17例,中分化 71例,低分化28例),腺癌44例(高分化4例,中分化32例,低分化8例)。年齡26-82歲,中位年齡59.6±9.5歲,≥60歲86例,<60歲 74例;腫瘤長徑D≥3.0cm 145例,D<3.0cm 15例;按淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移,有轉(zhuǎn)移76例,無轉(zhuǎn)移84例。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標(biāo)準進行分期,其中Ⅰ期患者31例,Ⅱ期患者43例,Ⅲ期患者34例,Ⅳ期患者52例。對照組正常肺組織20例取自肺癌腫塊>5.0cm的肺組織,病理 HE染色證實為正常肺組織。

2. 試劑

鼠抗人 CD34單克隆抗體(產(chǎn)品編號:MAB-0034,克隆號QBEnd/10)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;鼠抗人VEGF單克隆抗體(克隆號:C-1)購自Santa Cruz公司;ElivisionTMplus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。PAS染色液為蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科配制。

3. 實驗方法

3.1 采用免疫組織化學(xué) ElivisionTMplus法,將石蠟標(biāo)本以4μm厚連續(xù)切片,烤干,于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照,以PBS液代替一抗作空白對照。

3.2 CD34和 PAS套染 CD34染色,DAB顯色后,流水沖洗1min終止顯色反應(yīng),將切片置于0.5%高碘酸溶液中氧化5-8min。流水沖洗2min,再用蒸餾水洗1次,于暗處置于Schiff液中染色10-20min,然后用0.5%偏重亞硫酸鈉液滴洗2次,每次1min,流水沖洗2min;此后依次蘇木素淺染細胞核、鹽酸酒精分化、返藍、脫水透明以及中性樹膠封片。

3.3 微血管密度(MVD)計數(shù) CD34主要表達在血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)和胞膜,從而可以通過CD34的陽性表達來進行MVD計數(shù),參照修改過的Weidner[3]法來計數(shù)。

4. 結(jié)果判定

CD34和VEGF均以細胞膜和細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采取二次計分法:每例標(biāo)本隨機計數(shù)5個高倍視野(×400),計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分。首先將染色強度計分:0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分,0分為陰性,1分陽性細胞為<10%,2分為11%-50%,3分為51%-75%,4分為>75%。用染色強度得分和細胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達結(jié)果,若積分≤1為陰性,>1為陽性。免疫組化結(jié)果由高年資病理醫(yī)師讀片評定。

5. 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。VM和VEGF表達陽性組與陰性組生存分析用 Kaplan-Meier法,組間比較用log-rank檢驗,多因素分析采用Cox回歸多因素模型,VM和VEGF在NSCLC組織中表達與正常肺組織、各臨床及病理因素的相關(guān)性采用Fisher精確概率法Spearman等級相關(guān)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1. NSCLC中存在 VM(見圖1 A,B),除了見到為PAS陽性染色但CD34陰性的管腔樣結(jié)構(gòu)外,還可見到網(wǎng)絡(luò)狀VM[4],具有VM的腫瘤細胞附近不見壞死的腫瘤細胞及炎癥細胞。其中鱗癌中VM陽性率為35.3%(41/116),腺癌中VM陽性率為40.9%(18/44)。

2. NSCLC中VM與臨床病理的關(guān)系 VM與患者的性別、年齡、組織學(xué)類型等之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。VM陽性組的NSCLC比VM陰性組的 NSCLC分化差,差異有顯著性(P<0.05),PTNM分期Ⅰ-Ⅱ期VM陽性率為4.1%(3/74),Ⅲ-Ⅳ期VM陽性率為65.1%(56/86),VM組的PTNM分期比無VM組的PTNM分期相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且VM組的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)(表1)。

3. NSCLC中VEGF的表達及其與臨床病理的關(guān)系 VEGF主要表達于NSCLC癌細胞膜和細胞質(zhì),呈棕黃色(見圖 1 C,D)。對照組未見有VEGF表達,在NSCLC中VEGF蛋白陽性表達率為51.3%,其表達與患者性別、年齡及組織學(xué)類型無相關(guān)性(P>0.05)。隨著NSCLC的分化越低,VEGF的表達越強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGF的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05);Ⅰ-Ⅱ期腫瘤中VEGF的陽性率為16.2%(12/74),Ⅲ-Ⅳ期腫瘤中VEGF的陽性率為81.4%(70/86),兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

4. NSCLC中VM與VEGF表達的關(guān)系 在VM陽性組的病例中,VEGF陽性率為89.8%(53/59);在VEGF陽性表達的病例中,VM的陰性率為35.4%(29/82),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Spearman相關(guān)分析顯示,VM與VEGF在NSCLC中的表達呈正相關(guān)(r=0.590,P=0.000)(表2)。

5. 多因素分析 將病理組織分化(分為高分化組、中分化組與低分化組),年齡(分為≥60歲組與<60歲組)、PTNM分期(分為ⅠⅡ期組與Ⅲ Ⅳ期組)、腫瘤直徑(分為≥3.0cm組與<3.0cm組)、腫瘤位置(分為中央型組與周圍型組)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(分為有轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組)、性別(男性組與女性組)、VM(分為陽性組與陰性組)、微血管密度(microvessel density,MVD,因為 MVD的均值為22.42±12.8,故以MVD<22為陰性;MVD≥22為陽性)和VEGF(分為表達陽性組與陰性組)等因素引入Cox模型進行多因素分析,結(jié)果顯示:VM和VEGF的表達及 PTNM分期影響NSCLC根治術(shù)后患者預(yù)后的獨立因素(見表3)。

6. 生存分析 本組病例總的5年生存率為26.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示VM陽性組與陰性組5年生存率分別為1.7%和41.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);VEGF陽性組與陰性組5年生存率分別為2.4%和52.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000),生存曲線見圖2、圖3。

圖1 VM和VEGF在NSCLC中的陽性染色A和B:在NSCLC中VM陽性染色(黑箭頭所示為VM結(jié)構(gòu),紅箭頭所示為血管,A和B為低分化鱗癌 ElivisionTM×400);C和D:在NSCLC中VEGF表達陽性,主要表達于細胞膜和細胞質(zhì)(C為低分化鱗癌,D為中分化鱗癌,ElivisionTM×400)。Figure 1 Expression of VM and VEGF in NSCLC (ElivisionTM×400)A and B:positive staining of VM in NSCLC(black arrow is VM,red arrow is vessel,A and B are poor grading squamous carcinoma);C and D:positive staining of VEGF in membrane and cytoplasma of NSCLC(C is poor grading squamous carcinoma,D is mediate grading squamous carcinoma).

圖2 VM表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線圖3 VEGF表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線Fig 2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative VM expression.Fig 3 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative VEGF expression.

表1 160例NSCLC組織中VM和VEGF的表達與臨床病理因素的關(guān)系T able 1 Correlation of VM and VEGF expression to clinicopathologic characteristics of 160 patients with NSCLC

表2 NSCLC中VM與VEGF表達之間的關(guān)系Table 2 Correlation of VM expression to VEGF expression in NSCLC

表3 160例NSCLC患者多因素分析Table 3 Multivariate survival analysis of 160 patients with NSCLC

討 論

VM是高侵襲性腫瘤為了滿足自身的血液供應(yīng),瘤細胞通過自身變形和細胞外基質(zhì)重塑而圍成的一種類血管樣的管道,是一種不依賴血管內(nèi)皮細胞的一種腫瘤微循環(huán)模式,并與宿主血管相連,獲取血供。1999年美國學(xué)者Maniotis在研究高侵襲性葡萄膜黑色素瘤時發(fā)現(xiàn)腫瘤中除了存在由血管內(nèi)皮細胞圍成的血管外,同時存在由腫瘤細胞相互連接、細胞外基質(zhì)內(nèi)襯而形成的PAS陽性、CD34陰性的網(wǎng)狀管道結(jié)構(gòu),與原靜脈相連,甚至在某些空心管道中存在紅細胞,于是提出了血管生成擬態(tài)(VM)。形成VM的腫瘤細胞具有胚胎樣基因表型,使得腫瘤細胞可以表達與血管生成有關(guān)的標(biāo)記:如 VE-cad、VEGF、EphA2、MMP2、HIF-1α等。后來 ,在肝癌[5]、前列腺癌[6]、卵巢癌[7]以及骨肉瘤[8]等高度惡性的腫瘤都報道存在VM。

VM在腫瘤生物學(xué)中具有十分重要的意義。一方面缺血和缺氧是惡性腫瘤發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象,缺氧會誘導(dǎo)VEGF表達增加進而刺激腫瘤血管新生,但當(dāng)新生的血管還不能滿足腫瘤生長所需時,部分腫瘤細胞可能就會相互連接,形成擬態(tài)血管,給腫瘤組織供氧。另一方面,VM管道直接由腫瘤細胞圍成,腫瘤細胞與血流之間僅有一層PAS陽性的基底膜樣物相隔,無血管內(nèi)皮細胞屏障,因此腫瘤細胞釋放的蛋白水解酶能夠更容易地溶解基底膜樣物而使腫瘤細胞直接進入血液,從而有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

本實驗在59例NSCLC中發(fā)現(xiàn)了符合VM標(biāo)準的管道結(jié)構(gòu),證實在NSCLC中有VM的存在。同時表達VM的區(qū)域很少出現(xiàn)壞死,且VM的表達與細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床分期等密切相關(guān)。即表達VM的腫瘤具有低分化、臨床分期晚以及更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這與國內(nèi)外的文獻報道一致[9-10]。

VEGF及其受體是公認的介導(dǎo)新生血管形成的關(guān)鍵因素,是高度特異的促血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂素和血管生成中最主要的調(diào)節(jié)因子。VEGF的表達與腫瘤的病程及惡性程度密切相關(guān),能刺激內(nèi)皮細胞的增殖,有利于腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示VEGF的表達與NSCLC的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等呈正相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示VEGF的表達與患者的年齡、腫瘤的大小及組織學(xué)類型等無關(guān)。

目前,關(guān)于VEGF在惡性腫瘤血管生成擬態(tài)現(xiàn)象中的作用國內(nèi)外文獻報道結(jié)果不一。有人發(fā)現(xiàn)在有血管生成擬態(tài)的腫瘤中VEGF表達不僅沒有增加,甚至下降,認為原因可能是VM的存在使腫瘤細胞獲得足夠的血液供應(yīng),氧氣供應(yīng)充足,刺激腫瘤細胞分泌VEGF的主要誘因減弱,導(dǎo)致VEGF的表達降低[11-12]。但另外一些學(xué)者認為VEGF在腫瘤的VM形成過程中有極其重要的作用[10,13]。那么,VEGF在NSCLC的VM形成過程中是否也有重要的作用?其能否成為一個抗NSCLC的VM的靶點呢?本研究結(jié)果顯示,在NSCLC中,隨著VEGF的表達率的升高,VM的陽性率顯著升高,兩者呈正相關(guān)。提示在NSCLC的VM形成過程中,VEGF可能起到一個關(guān)鍵的作用。根據(jù)結(jié)果初步推測缺氧會誘導(dǎo)VEGF的表達增加進而誘導(dǎo)腫瘤血管新生,且缺氧還能夠誘導(dǎo)部分腫瘤細胞相互連接形成VM。在這個過程中,腫瘤細胞可以變形,而高表達的VEGF在這種細胞變形過程中可能起到一定的促進作用。

本研究多因素分析顯示VM和VEGF的表達、PTNM分期是影響NSCLC患者的獨立預(yù)后因素。進一步的生存分析顯示VM陽性組與陰性組的5年生存率分別為1.7%和41.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示VM陽性組比VM陰性組有更低的5年生存率,這與文獻報道結(jié)果相同[14];VEGF陽性組與陰性組的5年生存率分別為2.4%和52.6%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示VEGF的表達與腫瘤患者的生存率及生存期預(yù)后的估計可能有一定的指導(dǎo)意義。

VM的發(fā)現(xiàn)改變了人們以往對腫瘤血供的傳統(tǒng)觀念,VM的存在對現(xiàn)行的抗血管生成治療提出了挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果提示VEGF在NSCLC的VM形成過程中起重要的作用,但在不同腫瘤中的VM形成過程中是否起到同樣的作用?其機制是否相同?這需要通過進一步的實驗來了解。

[1]Hendrix MJ,Seftor EA,Hess AR,et al.Vasculogenic mimicry and tumor cell plasticity:lessons from melanoma.Nat Rev Cancer,2003,3(6):411-421

[2]Yue WY,Chen ZP.Does vasculogenic mimicry exist in asrtocytoma?JHistochem Cytochem,2005,53(8):997-1002

[3]Kumada T,Tsuneyama K,Hatta H,et al.Improved 1-h rapid immunostaining method using intermittent microwave irradiation:practicability based on 5 years application in Toyama Medical and Pharmaceutical University Hospital.Mod Pathol 2004;17(9):1141-1149

[4]Folberg R,Maniotis AJ.Vasculogenic mimicry.APMIS,2004;112(7-8):508-525

[5]趙秀蘭,杜靜,張詩武,等.肝細胞肝癌中血管生成擬態(tài)的研究.中華肝臟病雜志,2006,14(1):41-44

[6]Danny R,Gray I,Wendy J,et al.Short-term human prostate primary xenografts:an in vivo model of human prostate cancer vasculature and angiogenesis. Cancer Res,2004,64(3):1712-1721

[7]Sood AK,Seftor EA,Fletcher MS,et al.Molecular determinants of ovarian cancer plasticity.AmJ Pathol,2001,158(4):1279-1288

[8]Cai XS,Jia YW,Mei J,et al.Tumor blood vessels formation in osteosarcoma:vasculogenesis mimicry.Chin Med J,2004,117(1):94-98

[9]Folberg R,Hendrix MJ,Maniotis AJ.Vasculogenic mimicry and tumor angiogenesis.Am J Pathol,2000,156(2):361-381

[10]朱芳,李振宇,任精華等.VEGF與腫瘤血管生成擬態(tài)關(guān)系的研究.臨床腫瘤學(xué)雜志,2009,14(1):20-24

[11]郝希山,孫保存,張詩武等.雙向分化腫瘤血管生成擬態(tài)的組織微陣列研究.中華醫(yī)學(xué)雜志.2002,82(19):1298-1302

[12]郄碩,張濤武,張丹芳等.胃腸道間質(zhì)瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶2和9表達與血管生成擬態(tài)的關(guān)系.中華醫(yī)學(xué)雜志,2009,89(16):1106-1109

[13]Vartanian AA,Burova OS,Stepanova EV,et al.The involvement ofapoptosis in melanomavasculogenic mimicry.Melanoma Res,2007,17(1):1-8

[14]Shirakawa K,Wakasugi H,Heike Y,et al.Vasculogenic mimicry and pseudocomedo formation in breast cancer Int J Cancer,2002,99(6):821-828