Ezrin 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其與生存期關(guān)系的研究

唐 甜 陜 光

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科; 2武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科湖北 430060)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,占全身惡性腫瘤的1%。主要組織學(xué)類型包括乳頭狀癌、濾泡性癌、未分化癌以及髓樣癌,分別占整體甲狀腺癌的80%、15%、2%和4%[1]。近年來,我國甲狀腺癌的發(fā)病率呈明顯上升的趨勢。為了使甲狀腺癌患者得到正確診斷和及時有效治療,我們需要進(jìn)一步研究和探討甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制。

埃茲(Ezrin)作為一種將細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜聯(lián)結(jié)起來的特定蛋白,通過氨基端與細(xì)胞膜相連,羧基端與細(xì)胞骨架(肌動蛋白)相連,參與了微絨毛的形成及細(xì)胞形態(tài)的維持、運(yùn)動、黏附,并和生存有關(guān)[2-4]。Ezrin通過信號途經(jīng),與黏附分子、細(xì)胞因子等的作用參與了腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移,也有很多研究闡明了Ezrin表達(dá)水平或免疫反應(yīng)性與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后的相關(guān)性[5]。

通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測Ezrin蛋白在甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺腺瘤中的表達(dá)水平,以探討其在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的作用機(jī)制,為臨床上治療甲狀腺乳頭狀癌提供更多參考和指導(dǎo)。

材料和方法

1.材 料和分組

1.1 材料

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院和武漢大學(xué)中南醫(yī)院病理2000-2006年手術(shù)切除及活檢的甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本40例和甲狀腺腺瘤標(biāo)本20例。其中甲狀腺乳頭狀癌中男12例,女28例;年齡23-68歲。甲狀腺腺瘤中男6例,女14例;年齡20-60歲。隨訪時間為8-36個月,平均隨訪時間20.3個月,中位隨訪時間18個月。

1.2 分組

蠟塊切片厚5μm,粘片于涂有多聚賴氨酸的潔凈載玻片上,置于烤箱烤干待用。常規(guī) HE染色,用免疫組織化學(xué)S-P法檢測Ezrin蛋白在各組中的表達(dá)。

2.主 要試劑

濃縮型鼠抗人Ezrin單克隆抗體 (北京中杉生物技術(shù)有限公司);超敏即用型S-P通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司);顯色試盒及多聚賴氨酸(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

3.方 法

3.1 免疫組織化學(xué)S-P法檢測Ezrin相關(guān)抗原

5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性,Ezrin蛋白采用微波抗原修復(fù)(3檔,10 min),正常羊血清37℃孵育10min以減少非特異性反應(yīng),一抗37℃孵育1h,生物素標(biāo)記的二抗,37℃孵育10min,SP復(fù)合物處理10 min,DAB顯色液顯色,自來水沖洗終止反應(yīng),蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。用磷酸緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

3.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

(1)以胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照除細(xì)胞核染成藍(lán)色外,胞漿內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物。

(2)采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)對 Ezrin蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測定每個視野下Ezrin蛋白的陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計(jì)算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%

4.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和SN K-q檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.Ezrin的表達(dá)甲狀腺腺瘤組織中可見少量的棕黃色顆粒,Ezrin表達(dá)弱陽性(圖1);甲狀腺乳頭狀癌組織內(nèi)可見密集分布的棕黃色顆粒,Ezrin表達(dá)呈強(qiáng)陽性(圖2)。圖像分析結(jié)果顯示:甲狀腺腺瘤組織和甲狀腺乳頭狀癌組織之間Ezrin表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05)見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺腺瘤組織Ezrin表達(dá)的平均光密度和陽性面積率(ˉx±s)Table 1 The average optical density and the rate of positive area of Ezrin protein inthyroid papillary carcinoma and in Thyroid gland adenoma tissue(ˉx ±s)

2.Ezrin表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者總生存期的關(guān)系

40例甲狀腺乳頭狀癌和20例甲狀腺腺瘤完整資料的病例都獲得隨訪。Ezrin表達(dá)強(qiáng)陽性組總生存期平均為(14.21±2.03)個月,中位總生存期為13個月;Ezrin表達(dá)弱陽性組平均總生存期為(25.40±3.19)個月,中位總生存期為26個月。2年生存率強(qiáng)陽性組、弱陽性組分別為32.4%和78.9%。強(qiáng)陽性組總生存期明顯短于表達(dá)弱陽性組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

甲狀腺癌(TC)在頭頸部腫瘤中居首位。其組織學(xué)類型主要包括乳頭狀癌(PTC),濾泡狀癌(FTC),未分化癌(ATC)和髓樣癌(MTC),以 PTC所占比例最大[6]。乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的類型,屬于一種低度惡性腫瘤[7-10],多發(fā)于20-50歲的成年人,男女比例約為1:3-4。盡管15歲以下的兒童和青少年很少發(fā)生PTC,但PTC仍然是最常見的兒童型甲狀腺癌。有文獻(xiàn)報導(dǎo)PTC患者五年存活率女性為94%,男性為90%[11-13]。盡管大多數(shù)PTC患者表現(xiàn)為無痛性甲狀腺腫塊,治療后無病生存期長且治愈率高,但PTC的一些組織學(xué)亞型具有胞膜侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性,導(dǎo)致病人死亡。早期診斷和及時正確的治療是提高生存率的關(guān)鍵。深入認(rèn)識甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制,將有可能為治療提供新的線索和途徑。

Ezrin即為近年在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究中的相關(guān)蛋白,大量研究表明該蛋白在很多腫瘤組織中都有異常表達(dá),并與促腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。Ezrin基因定位于染色體6q25.2-q26,mRNA全長為3166 bp,編碼585個氨基酸。Ezrin幾乎在所有組織中表達(dá),但在不同組織中的表達(dá)水平差異有顯著性[14]。正常組織細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及基質(zhì)三者之間的黏附連接對腫瘤的生長侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移非常重要,Ezrin是這一環(huán)節(jié)的中心體。Ezrin表達(dá)增強(qiáng),致使腫瘤細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng),同時 E-cadherin遭破壞,在細(xì)胞與細(xì)胞之間的表達(dá)能力下降,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自瘤組織中脫落,引起腫瘤的轉(zhuǎn)移[15-18]。

Ezrin在控制細(xì)胞形態(tài)上扮演重要角色,是細(xì)胞運(yùn)動和形態(tài)學(xué)調(diào)控的關(guān)鍵因素,控制著肌動蛋白的裝配與拆卸,調(diào)節(jié)肌動蛋白絲的長度、極性、穩(wěn)定性和三維結(jié)構(gòu);同時還參與胞吞、胞吐、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞運(yùn)動等功能[19-20]。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:甲狀腺腺瘤組織中Ezrin呈弱陽性表達(dá);甲狀腺乳頭狀癌組織中Ezrin表達(dá)呈強(qiáng)陽性。圖像分析結(jié)果顯示:甲狀腺腺瘤組織和甲狀腺乳頭狀癌組織之間Ezrin表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:Ezrin在腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用,Ezrin的過度表達(dá)破壞了細(xì)胞的信號網(wǎng)絡(luò)平衡,使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)器丟失,并放大了細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)移信號結(jié)構(gòu),過度表達(dá) Ezrin通過破壞細(xì)胞信號的平衡,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

我們還通過對Ezrin表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者總生存期的關(guān)系的分析,結(jié)果顯示:Ezrin表達(dá)強(qiáng)陽性組總生存期均短于表達(dá)弱陽性組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Ezrin的高表達(dá)可以作為腫瘤患者低生存率的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志。這些研究結(jié)果提示Ezrin可為腫瘤治療提供了新的靶位點(diǎn)。

總之,Ezrin作為細(xì)胞表面的特殊裝置,參與了細(xì)胞間的交流及細(xì)胞間粘附作用?；罨陌Ｆ澋鞍追肿覥端與F一肌動蛋白連接,N端與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)連接,埃茲蛋白能夠與細(xì)胞表面粘附分子及受體的直接連接,因此,Ezrin與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

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圖 版 說 明

圖1 Ezrin在甲狀腺腺瘤中的表達(dá)可見少量的棕黃色顆粒,Ezrin表達(dá)弱陽性(S-P×200);

圖2 Ezrin在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá) 可見密集分布的棕黃色顆粒,Ezrin表達(dá)呈強(qiáng)陽性(S-P×200);

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Expression of Ezrin protein in Thyroid gland adenoma Tere were few brown particles in the cytoplasm of Cancer side tissue,Ezrin protein was weakly masculine.S-P×200

Fig.2 Expression of Ezrin protein in the cytoplasm of thyroid papillary carcinoma There were plenty of brown particles in the cytoplasm of thyroid papillary carcinoma.Ezrin protein was strongly masculine.S-P×200