用于“治療性克隆”人胚胎干細胞研究面臨的問題與可能的解決辦法

戴甲培，宋文強，肖愛武，羅 藝，孫 燕

(1中南民族大學(xué)武漢神經(jīng)科學(xué)和神經(jīng)工程研究所，武漢430074;2中國人腦庫中心，武漢430074)

胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)尤其是人胚胎干細胞(hESC)的建立、研究和應(yīng)用，被認為是繼“人類基因組計劃”之后，在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)史上的又一革命性進展.目前，有關(guān)干細胞的研究進展表明，開展個性化干細胞治療是臨床應(yīng)用的最終目標，而利用“治療性克隆”技術(shù)獲取人胚胎干細胞是實現(xiàn)這一目標的重要手段.本文就人胚胎干細胞的“治療性克隆”的研究進展、研究面臨的困難以及有望解決的措施進行簡要的綜述.

1 人胚胎干細胞的研究意義及應(yīng)用前景

人胚胎干細胞(hESC)一般來自由體外受精卵發(fā)育成的囊胚期胚胎的內(nèi)細胞團，具有保持未分化狀態(tài)及多向分化潛能的無限增殖能力.hESC可在體外定向誘導(dǎo)分化為多種細胞類型，因而在研究人胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生、器官和細胞移植治療、基因治療、藥物篩選與新藥開發(fā)方面，hESC具有廣闊的應(yīng)用前景.例如:誘導(dǎo)人胚胎干細胞向胰島細胞方向分化而產(chǎn)生胰島內(nèi)胚層細胞，通過移植這些細胞可用于治療糖尿?。?］;將人胚胎干細胞經(jīng)血管內(nèi)或直接注射到病變的心臟部位，可再生為心肌細胞，用于治療嚴重缺血引起的心肌壞死(心肌梗死)，動物實驗的研究結(jié)果也證實了這種方法的有效性［2］.20世紀90年代，將人胚胎干細胞用于治療一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如帕金森病等已取得一定療效，然而人胚胎干細胞的來源有限，加之在個性化治療方面存在的技術(shù)問題(如免疫排斥)，使之尚無法廣泛應(yīng)用，但人胚胎干細胞的利用仍不失為治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的重要手段.此外，人胚胎干細胞還可用于治療組織損傷(如脊髓損傷)和新藥開發(fā).從患者身上獲取體細胞并誘導(dǎo)形成疾病特異的多能干細胞，對了解疾病發(fā)生機理、藥物篩選和毒性研究有著重要意義［3，4］.由此可見，干細胞技術(shù)的不斷發(fā)展實現(xiàn)了在細胞和分子水平對人類疾病發(fā)病機制的研究，而以細胞為模型尋找新的藥物作用靶標或進行新藥臨床實驗將比傳統(tǒng)方法更為精準和有效［5］.目前，有關(guān)干細胞的研究進展表明，開展個性化干細胞治療是臨床應(yīng)用的最終目標，而利用“治療性克隆”技術(shù)獲取人胚胎干細胞是實現(xiàn)這一目標的重要手段.

2 獲得人胚胎干細胞的主要途徑及存在的問題

目前獲得人類干細胞進行研究和臨床治療的方法主要有3種(如圖1A-C):(1)使用受精卵發(fā)育成胚胎時所產(chǎn)生的胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)，主要來源于流產(chǎn)和進行體外受精(In vitro fertilization，IVF)等人工輔助生殖(試管嬰兒)過程中的多余胚胎.2010年底，美國食品和藥物管理局已批準美國Geron公司和先進細胞技術(shù)公司使用人胚胎干細胞(hESC)治療脊髓損傷和斯特格氏癥(又稱少年黃斑變性)的人體臨床實驗(www.geron.com或 www.advancedcell.com)，其使用的胚胎干細胞系即來源于體外受精生殖過程中的多余胚胎.然而，由于胚胎來源非常有限，利用這樣的胚胎干細胞進行廣泛而大量的研究以及個性化臨床應(yīng)用仍存在著諸多困難.此外，病人和獲得的胚胎干細胞的基因非同源性還可引起免疫排斥等問題［6］.(2)使用化學(xué)和生物分子(如特定的細胞轉(zhuǎn)錄因子)誘導(dǎo)的方法使人類體細胞(如皮膚細胞)重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型，稱之為誘導(dǎo)性多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPS cells).iPS 細胞是目前干細胞研究領(lǐng)域的熱點，然而，通過這種方法獲得的干細胞在用于人類臨床治療之前還面臨著轉(zhuǎn)化效率低、安全性不佳等問題.動物實驗表明，iPS細胞植入體內(nèi)有導(dǎo)致癌癥的可能性［7-12］.(3)使用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)(Somatic cell nuclear transfer，SCNT)或細胞融合技術(shù)(Cell fusion)克隆人類早期胚胎并提取干細胞，即所謂的“治療性克隆”(Therapeutic cloning)技術(shù).體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)提取的胚胎干細胞具有發(fā)育成各種細胞類型的可能性，然后將它們植入病人的受損組織(如胰腺、心臟、脊髓、角膜、腦組織等)中，可能起到修補的作用.若使用病人自己的體細胞，還可以消除免疫排斥問題［12，13］.2008年，美國紐約Sloan-Kettering研究中心的研究人員在帕金森病模型鼠身上利用治療性克隆技術(shù)獲得了成功，為該技術(shù)用于臨床治療揭開了新的篇章.

3 治療性克隆人胚胎干細胞面臨的困難及解決辦法

利用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)和病人的體細胞(如皮膚細胞)克隆出了早期胚胎，并提取出新的胚胎干細胞系是目前進行干細胞個性化治療的重要手段，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景.然而，該技術(shù)的研究和最終臨床應(yīng)用需要大量的成熟卵細胞，通過女性捐獻卵細胞來開展這方面的工作仍有許多難點［13］.為解決這一難題，目前有科學(xué)家使用動物卵細胞替代人卵細胞進行異種混合胚胎(Hybrid embryos)實驗［14］.異種混合胚胎可分為3種:第1種是將某種動物的精子與另一種動物的卵子結(jié)合為受精卵，這類研究在倫理學(xué)上是不允許的，而且存在多種技術(shù)障礙，第2種稱之為“嵌合體”，就是將某種動物的胚胎干細胞注入另一種正在發(fā)育的動物胚胎中，令其發(fā)育為2種動物細胞混雜的胚胎，國際上對此類研究基本上不允許的;第3種則是運用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)將一種動物或人的體細胞核注入去核的牛、兔、羊或豬的成熟卵母細胞，以培養(yǎng)早期胚胎(囊胚)，并從中提取胚胎干細胞.到目前為止，“人-牛嵌合體”、“人-羊嵌合體”、“人-兔嵌合體”和“人-豬嵌合體”等初步實驗已獲得成功［14］.2008年，英國人類受精與胚胎學(xué)管理局(HFEA)批準了這一類人獸混合胚胎的實驗(www.hfea.gov.uk).2009 年，美國明尼蘇達大學(xué)Schulze糖尿病研究所(University of Minnesota＇s Schulze Diabetes Institute in Minneapolis)的研究人員在美國“科學(xué)”雜志上敘文聲稱，他們將使用世界上最干凈的豬來進行這方面的研究，以探討利用“人-豬嵌合體”胚胎干細胞移植來治療糖尿病的可能性［15］.新西蘭和俄羅斯等國家也在開展類似的研究.

圖1 胚胎干細胞的3個主要來源Fig.1 Threemain sources for embryonic stem cells

然而，將異種混合胚胎應(yīng)用到人身上必定會遇到倫理和其它方面的問題.雖然DNA主要存在于細胞核中，但細胞質(zhì)中也有少量的遺傳物質(zhì)即線粒體DNA(mtDNA)，它負責(zé)編碼與線粒體功能相關(guān)的13個基因，主要是為生命活動提供能量.比起細胞核中的幾萬個人類基因，這13個線粒體基因似乎顯得“微不足道”，然而這樣的研究最終用于臨床還是存在很大的風(fēng)險，如動物的線粒體是否會與人的線粒體或其它成分發(fā)生相互作用.而更大的風(fēng)險在于病毒，有的病毒對動物無害卻對人有害.人獸胚胎的研究難度很大，加之觸及了人類倫理觀念，在社會各界仍存在不少爭議.由此可見，人胚胎干細胞的“治療性克隆”研究仍面臨著許多困難，離臨床應(yīng)用還有相當長的路要走，而獲取人成熟卵細胞所面臨的種種困難是進行人類“治療性克隆”研究和臨床應(yīng)用的主要障礙.

4 獲得人成熟卵細胞的改良方法及需要注意的問題

克服獲取人成熟卵細胞所面臨的困難對于進行人類“治療性克隆”的研究和臨床應(yīng)用將具有重要意義.戴甲培(Dai Jiapei)等在早期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，從死亡后人腦組織獲得的神經(jīng)細胞經(jīng)復(fù)蘇后能恢復(fù)功能［16-19］，隨后其它的研究人員也發(fā)現(xiàn)利用死亡后的人腦組織能培養(yǎng)神經(jīng)細胞和神經(jīng)干細胞進行功能研究［20-23］.這些研究啟發(fā):能否從人死亡后的卵巢中取出未成熟的腔前卵泡(包括原始和初級卵母細胞)進行體外培養(yǎng)來獲得成熟的人卵細胞?如果這種設(shè)想能成功，將獲得大量的人成熟卵細胞，因為一個新生兒兩側(cè)卵巢有100～200萬個原始卵泡(Primordial follicles)，青春期也約有4萬個腔前卵泡可供利用，克服了人類“治療性克隆”研究和臨床應(yīng)用面臨的主要難題.我們在前期的動物實驗中發(fā)現(xiàn)，從死亡后24 h或48 h的昆明小鼠(16～20 d)卵巢中分離出的腔前卵泡在進行細胞復(fù)蘇和體外培養(yǎng)后，能獲得成熟的卵細胞(待發(fā)表的資料).這一結(jié)果為我們利用人死亡后卵巢培育可供“治療性克隆”研究和臨床應(yīng)用的人成熟卵細胞帶來了希望.此外，利用這種方法獲得的成熟卵細胞在很大程度上能夠避開法律和倫理學(xué)方面的問題.目前，國內(nèi)有關(guān)遺體捐獻用于科學(xué)研究的法律法規(guī)已日臻成熟，為利用人體組織進行科學(xué)研究提供了有力保障(www.cbbcnet.org.cn)［24］.

然而，利用人死亡后卵巢體外培育成熟卵母細胞供“治療性克隆”的研究和臨床應(yīng)用仍存在一些亟待解決的問題.首先，是如何克服細胞復(fù)蘇和培養(yǎng)過程中的細胞凋亡.器官移植的研究表明，導(dǎo)致各種組織器官壞死的主要原因是缺血再灌注而并非缺血、缺氧本身.如單純凍存肝組織16 h并不會出現(xiàn)細胞凋亡，若在凍存8 h或16 h后再灌注1 h，肝竇內(nèi)凋亡細胞數(shù)會顯著增加［25］;大鼠肺組織凍存20 min、6 h及12 h后細胞死亡率均很小，若在凍存6 h或12 h后再灌注處理2h，細胞凋亡率將明顯增高［26］;用器官保存液或生理鹽水分別灌注已凍存6 h及18 h的胰腺組織2 h，結(jié)果顯示，生理鹽水灌注組的細胞凋亡數(shù)要多于器官保存液灌注組，且凍存18 h的胰腺組織凋亡率更高.由此推測，缺血再灌注可引起胰腺腺泡細胞凋亡，且細胞凋亡程度與凍存時間相關(guān)［27］;另有研究也證實，缺血再灌注與心臟移植術(shù)后的細胞凋亡有關(guān)［28］.其次，是如何有效地將腔前卵泡體外培養(yǎng)為成熟卵細胞.腔前卵泡的培養(yǎng)，即原始卵泡向初級卵泡的轉(zhuǎn)化過程，是該技術(shù)成功用于治療性克隆的一個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié).將腔前卵泡培養(yǎng)為成熟卵泡與將次級卵泡培養(yǎng)到成熟卵泡有很大不同，前者需要啟動腔前卵泡發(fā)育程序，即通常所說的細胞重編程過程 (Cell reprogramming).只有啟動了腔前卵泡發(fā)育程序，才能實現(xiàn)從初級卵泡經(jīng)次級卵泡發(fā)育到成熟卵泡，這一過程涉及許多細胞重編程的基因和分子機制，是目前卵泡發(fā)育研究的重點和難點［29-36］.此外，通過這種方法獲得的人成熟卵細胞最終用于臨床還需考慮以下問題:(1)如何長期保存培養(yǎng)成熟的人卵細胞;(2)如何結(jié)合體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)克隆人類早期胚胎;(3)如何從克隆的人類早期胚胎(囊胚期)提取并培養(yǎng)干細胞.因此，解決人成熟卵細胞的來源問題對于加快“治療性克隆”的臨床應(yīng)用將提供重要的基礎(chǔ).

5 結(jié)語

目前，利用體細胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)克隆人類早期胚胎和提取干細胞的研究在國內(nèi)已取得初步成功，但都是通過女性捐獻卵細胞來開展研究工作.由于卵細胞來源困難，除了克服技術(shù)上的問題，如何獲得一定數(shù)量以及高質(zhì)量的人成熟卵細胞是成功的關(guān)鍵.若能利用人死亡后卵巢組織大量培育人成熟卵細胞，那將為開展克隆人早期胚胎和胚胎干細胞的研究帶來足夠資源，并為最終用于臨床治療帶來新的希望.

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