真武湯對慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

陳國慶 姚淮芳

1安徽中醫(yī)學(xué)院（安徽合肥230038）

2安徽省中醫(yī)院（安徽合肥230031）

慢性心力衰竭（CHF）的基本病因是原發(fā)性心肌損害以及前后負(fù)荷增加，與交感神經(jīng)興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活密切相關(guān)。近年來研究證明，心肌細(xì)胞凋亡是CHF過程中心肌細(xì)胞喪失的重要機(jī)制，心肌細(xì)胞凋亡亢進(jìn)參與了CHF的基本病理生理進(jìn)程［1-2］。心肌細(xì)胞凋亡是心肌肥大向心衰轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。因此，抑制心肌細(xì)胞的凋亡對心衰的治療十分重要。選擇有效的藥物進(jìn)行早期干預(yù)，打斷心力衰竭的惡性循環(huán)，就可延緩心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1．1 動物及藥物 健康雄性 wistar大鼠 60只，體質(zhì)量200～240g，購于安徽全椒動物公司。真武湯組成：熟附片10g，茯苓15g，白術(shù)10g，生姜15g，白芍15g。按比例配伍組成，加入500mL水，煎30min，過濾濃縮至1．0g/mL，由安徽省中醫(yī)院制劑中心提供。注射用青霉素，由華北制藥股份有限公司提供，批號：X1002321。依那普利片，由江蘇揚(yáng)子藥業(yè)公司提供，批號H3202731。

1．2 主要試劑 Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR試劑和Taq DNA聚合酶，DNA Marker（美國Fermentas公司）、瓊脂糖凝膠（OXOID，英國），溴化己錠（10mg/mL，Sigma 公司，美國），引物用Primer Premier 5．0軟件設(shè)計(jì)，并由上海生工技術(shù)有限公司合成。bcl-2、bax、β-actin兔抗人單克隆抗體：購于博士德生物工程有限公司。羊抗兔IgG（辣根過氧化物酶標(biāo)記），購于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。EZ-ECL增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒，購于Biological Industries公司。PVDF膜，購于Millipore公司。麗春紅，購于碧云天生物技術(shù)研究所?？捡R斯亮藍(lán)G-250，購于上?；瘜W(xué)試劑廠?？捡R斯亮藍(lán)G-250蛋白測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究?？贵w稀釋液，購于博士德生物工程有限公司。

1．3 主要儀器 PCR儀器（美國ABI公司），DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），TGL-18R冷凍離心機(jī)（黑馬儀器公司），TGL-16H冷凍離心機(jī)（黑馬儀器公司），紫外觀察燈UV型（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），GSM凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（3．0），組織勻漿器，電子天平（JY2002，F(xiàn)A2004，上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠）。

1．4 分組與造模 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、真武湯組、依那普利組。每組15只。采用腹主動脈縮窄法制作CHF大鼠模型［3］：大鼠經(jīng) 10%烏拉坦（1．0g/kg）腹腔注射麻醉后，行腹部正中切開，分離腎動脈上方的腹主動脈約1cm長，用7號針頭緊貼腹主動脈平行放置，并將兩者一起結(jié)扎，然后抽出7號針頭，即可使腹主動脈部分狹窄。術(shù)后，大鼠給予青霉素10000U，連續(xù)3d以預(yù)防感染。所有大鼠均飼以鼠飼料及瓶裝飲用水。各組均于造模4周后開始給藥。每日晨9：00，大鼠經(jīng)口腔插管于胃內(nèi)，真武湯組予真武湯 3mL/（kg·d），依那普利組予依那普利 10mg/（kg·d），假手術(shù)與模型組予生理鹽水 3mL/（kg·d）。

1．5 血流動力學(xué)指標(biāo)測定 腹主動脈結(jié)扎3周后，觀察實(shí)驗(yàn)動物是否出現(xiàn)失代償癥狀，如呼吸急促、心動過速和勞力性呼吸。以0．3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分離頸總動脈，插入聚苯乙烯左心導(dǎo)管至左心室，連接八導(dǎo)生理記錄儀（RM-600型）記錄其左心室壓峰值（LVP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左室內(nèi)壓最大收縮率 （+LV dp/dtmax）、左室內(nèi)壓最大舒張率（－LVdp/dtmax）及平均動脈壓（MAP）和心率（HR）。

1．6 RT-PCR方法測定Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá) 取大鼠心肌組織，常規(guī)方法提取RNA，按RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增Bcl-2、Bax目的基因片段。Bcl-2上游引物：5′-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3′， 下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′， 擴(kuò)增片段長度為 431bp；Bax 上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′， 下 游 引 物 ：5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′，擴(kuò)增片段 284bp；內(nèi)參照 β-actin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，擴(kuò)增片段長度為 500 bp。PCR 反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 5min，94℃ 35s，54℃ 35s，35 個循環(huán)后，72℃ 35s，72℃延伸 5min，4℃ 99min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。用各目的基因片段密度值/內(nèi)參照密度值的比值進(jìn)行比較。

1．7 Western Blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 取大鼠心肌組織，常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，用一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗3次后加二抗 HRP（辣根過氧化酶）-IgG（1∶1000），室溫孵育 2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用各蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進(jìn)行比較。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以（x±s）表示，應(yīng)用 SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件。用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 真武湯對心衰大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響 見表1。假手術(shù)組與模型組相比具有顯著差異（P＜0．01），模型組與中藥組、西藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），中藥組與西藥組比較無顯著差異。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

表1 各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)比較 （±s）

與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。下同。

組 別心率（次/min）-3123．89±989．57△△ 428．36±39．58△△-1342．87±826．48 328．17±32．73-2578．35±671．37△ 389．25±32．57△-2279．78±1297．68△ 372．40±27．68△n -dp/dtmax（mmHg/ms）15 15中藥組 15西藥組 15假手術(shù)組模型組LVSP（mmHg）135．09±28．09△△72．67±13．67 109．19±13．42△112．09±21．14△LVEDP（mmHg）12．98±9．87△34．45±10．01 7．89±11．36△5．98±12．03△+dp/dtmax（mmHg/ms）4523．17±1021．67△△1627．79±698．12 3421．17±874．02△3462．48±931．17△

2．2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2、BaxmRNA 及蛋白表達(dá)均顯著上升（P ＜ 0．01）；與模型組相比，真武湯組Bcl-2mRNA及蛋白表達(dá)均顯著上升，BaxmRNA 及蛋白表達(dá)均顯著下降（P＜0．05 或 0．01）。 見表 2、圖 1。

3 討 論

真武湯是醫(yī)圣張仲景《傷寒論》中溫陽利水代表方，主治少陰病陽虛水泛證。少陰病與CHF有密切的相關(guān)性，充血性心力衰竭心排出量不足時，末梢循環(huán)減弱，末梢血管收縮，表現(xiàn)為肢端發(fā)冷、蒼白、脈微細(xì)。這與少陰病心腎陽虛推血無力，陽氣不能溫煦四肢的見癥是相同的。據(jù)此許多學(xué)者應(yīng)用真武湯治療CHF取得了顯著療效。本研究表明，真武湯對CHF心肌細(xì)胞凋亡有良好的抑制作用，作用與依那普利組相當(dāng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡為該方改善CHF的主要機(jī)制之一，也為臨床治療心力衰竭提供參考。

本文結(jié)果顯示，模型組有大量的心肌細(xì)胞凋亡，而假手術(shù)組幾乎沒有心肌細(xì)胞凋亡。盡管TUNEL標(biāo)記陽性（凋亡小體）的細(xì)胞不一定是心肌細(xì)胞，但是近來的文獻(xiàn)報(bào)道幾乎所有的凋亡小體都是心肌細(xì)胞［4-5］。心肌細(xì)胞凋亡伴隨著上調(diào)有促進(jìn)調(diào)亡作用的Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)有抑制凋亡作用的Bcl-2蛋白表達(dá)，提示調(diào)亡蛋白表達(dá)失衡，促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)了CHF的發(fā)生、發(fā)展［6］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組有大量的心肌細(xì)胞凋亡，表明細(xì)胞凋亡在CHF的發(fā)展過程中起了一定的作用，通過細(xì)胞凋亡喪失心肌細(xì)胞促進(jìn)了CHF的發(fā)生發(fā)展。并且左室舒張末壓升高、收縮末期壓降低、室內(nèi)壓最大上升速度與下降速度均減少，左心收縮功能、舒張功能明顯的下降，也發(fā)生了一定程度的心室重構(gòu)，心肌細(xì)胞凋亡與心功能降低、心室重構(gòu)有較強(qiáng)的相關(guān)性。

表2 各組 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 （±s）

表2 各組 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 （±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0．01。

組 別 Bcl-2 Bax n mRNA 蛋白 mRNA 蛋白0．41±0．04 0．63±016*真武湯組0．37±0．03 0．57±0．15*0．58±0．03△△依那普利組 0．68±0．16 1．47±0．14△△ 0．55±0．11△ 1．41±0．13△△假手術(shù)組0．66±0．04模型組 1．01±0．19*15 15 15 15 1．04±1．13△△0．91±0．13 1．18±0．15*2．12±0．26△△0．77±0．08△△

圖1 各組Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表達(dá)電泳圖

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