ERCC1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義

鄧首軍，郭 剛，陳 楠，李高峰

(昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科，昆明650118)

肺癌是全世界癌癥中發(fā)病率和病死率最高的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生存。其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%。手術(shù)是早期NSCLC的主要治療手段，但術(shù)后的長期生存并不樂觀，輔助化療僅少部分患者從中受益。目前Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb期NSCLC患者的5年生存率分別是70%、60%、55%和40%［1］。如果能有生物標(biāo)記作為標(biāo)準(zhǔn)來幫助篩選患者進(jìn)行治療，不僅能提高療效，還可避免不必要的不良反應(yīng)。為此本研究探討了核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementing gene 1，ERCC1)在 NSCLC中的表達(dá)及預(yù)后意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院2003年1月至2004年12月手術(shù)切除并經(jīng)我院病理科確診的NSCLC標(biāo)本117例，所有患者術(shù)前均未接受過放化療等抗腫瘤治療，117例患者均有完整的臨床隨訪資料，根據(jù)2004年美國腫瘤學(xué)會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)年會公布的NSCLC臨床指引為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期。Ⅰ期57例、Ⅱ期60例，所有患者血常規(guī)及肝、腎功能基本正常。隨訪截止時(shí)間為2009年12月，生存時(shí)間的計(jì)算為手術(shù)日期到隨訪截止日期，或因復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡的日期。46例對照標(biāo)本取自同時(shí)期肺大疤、炎性假瘤等良性腫瘤旁，經(jīng)病理證實(shí)的正常肺組織。兩組患者的一般資料有可比性。

1.2 組織芯片制作 將肺癌及癌旁正常對照標(biāo)本制作成組織芯片(技術(shù)由Neomarkers公司提供)，簡要步驟如下:存檔供體蠟塊經(jīng)病理專家復(fù)診定位作標(biāo)記后，應(yīng)用組織陣列儀從供體蠟塊標(biāo)記點(diǎn)穿刺取材(6 mm)，每塊取兩點(diǎn)，分別植入受體蠟塊已打好的陣列孔中，將布陣好的受體蠟塊切片，厚4 μm，撈片，烤片后再次復(fù)診，制成可供免疫組化染色的切片數(shù)張。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)法(SP法)檢測上述NSCLC及癌旁組織中ERCC1蛋白的表達(dá)。鼠抗人ERCC1單克隆抗體購自美國Neomarkers公司，工作濃度為1∶80;SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司;組織芯片經(jīng)微波抗原修復(fù)后，蒸餾水洗5 min×2次，PBS沖洗5 min×1次;滴加1∶80鼠抗人ERCC1單抗，4℃冰箱孵育過夜。切片用磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。加鼠抗人ERCC1單克隆抗體，37℃水浴箱孵育20 min。切片用磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×3次。新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，鏡下觀察，蘇木素復(fù)染、水洗，中性樹脂封片、編號。已知陽性切片在同一條件下染色作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定 以細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒定為陽性細(xì)胞。每個(gè)組織隨機(jī)選取原始放大倍數(shù)×40，計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)。參照Wachters等［2］來分析免疫組化ERCC1的表達(dá)水平，不著色或陽性細(xì)胞數(shù)＜10%定為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%定為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩組患者生存分析采用Kaplan-Meier曲線。多因素生存分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1在肺癌組織中的表達(dá) ERCC1蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)為陽性(圖1、2)。

圖1 肺癌細(xì)胞核中ERCC蛋白陰性表達(dá)(×20)

圖2 肺癌細(xì)胞質(zhì)中ERCC蛋白陽性表達(dá)(×40)

2.2 ERCC1在肺癌組織中與臨床病理特征的關(guān)系

ERCC1在117例肺癌和46例正常肺組織的陽性表達(dá)率分別為 39.3%(46/117)，15.2%(7/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.739，P=0.003);ERCC1 在NSCLC的表達(dá)與肺癌的分化程度和組織學(xué)分型有關(guān)(P＜0.05);而與腫瘤TNM分期、性別、年齡、吸煙情況均無關(guān)(表1)。

表1 ERCC1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 ［例(%)］

2.3 ERCC1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 ERCC1表達(dá)陽性組的5年生存率為41.6%，中位生存期為52.5個(gè)月;陰性組5年生存率為28.0%，中位生存期為38個(gè)月;兩組間生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.621，P=0.006)(圖 3)。通過對本組 NSCLCN 患者的性別、年齡、病理類型、分化程度、TNM分期、吸煙史及ERCC1表達(dá)的COX多因素分析示，僅TNM分期是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.010，RR=5.715，95%CI:2.136 ～13.257)。

圖3 ERCC1表達(dá)陽性組和陰性組生存曲線

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌占80%。DNA損傷所致基因突變得不到有效的修復(fù)，是影響肺癌發(fā)生和預(yù)后的一個(gè)重要因素。DNA損傷修復(fù)能力的降低可增加肺癌的遺傳易感性［3］。

ERCC1是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)的關(guān)鍵生物分子，位于染色19q13.2，是核酸剪切修復(fù)途徑中具有特異性的重要組成部分，ERCC1基因的表達(dá)產(chǎn)物與DNA修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因F形成緊密的異二聚體，該二聚體是一個(gè)特異性的連接5'端的核酸內(nèi)切酶，具有損傷識別和切除5'端的雙重作用，在防止癌變中有著重要作用［4］。

由于標(biāo)本來源及樣本量的不同，關(guān)于ERCC1與肺癌臨床病理特征的關(guān)系文獻(xiàn)報(bào)道尚存在爭議。Ota等［5］對73例NSCLC術(shù)后組織標(biāo)本中ERCC1的檢測示肺癌組織和鄰近癌旁正常肺組織ERCC1的表達(dá)無關(guān)，其表達(dá)與年齡、性別、病理分期、吸煙情況無關(guān)，而與病理類型顯著相關(guān)，腺癌較鱗癌ERCC1高表達(dá)。而Wachters等［2］報(bào)告ERCC1表達(dá)水平以肺鱗癌最高，而肺腺癌最低。Azuma等［6］研究顯示，ERCC1表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期無相關(guān)性，而與年齡、性別、病理類型及有無胸膜、血管侵襲顯著相關(guān)，在男性、＜55歲、無胸膜及血管侵襲的腺癌患者中ERCC1高表達(dá)。本研究顯示，ERCC1的陽性表達(dá)率為 39.3%，與相關(guān)報(bào)道相近［2，6］。ERCC1 在肺癌及癌旁正常肺組織的表達(dá)，與性別、年齡、病理類型、吸煙情況無關(guān)，與腫瘤TNM分期，分化程度和組織學(xué)分型有關(guān)，TNM分期越高、分化程度越差，ERCC1表達(dá)的陽性率越低，提示ERCC1低表達(dá)預(yù)示腫瘤有較高的侵襲性及預(yù)后不良。

近年來研究報(bào)道ERCC1的表達(dá)與肺癌預(yù)后及鉑類化療耐藥有關(guān)，在早期術(shù)后患者中ERCC1高表達(dá)者生存時(shí)間顯著延長，預(yù)后好，可作為指導(dǎo)預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。而在接受鉑類化療的晚期NSCLC患者中，ERCC1陽性表達(dá)者反而較陰性者預(yù)后差，ERCC1陰性者無病生存期及總的生存期較陽性者明顯延長［7］。本研究117例術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療的肺癌患者ERCC1陽性表達(dá)者生存期顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于肺癌生存期受腫瘤TNM分期、病理類型等多種因素的影響，多因素分析顯示ERCC1并不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，但在＞60歲、男性、不吸煙、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、早期鱗癌患者，ERCC1陽性表達(dá)有較好的生存趨勢(P＜0.05)。DNA損傷需要多種損傷修復(fù)途徑通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互作用協(xié)同完成［8］。研究顯示ERCC1表達(dá)與其呈顯著正相關(guān)，因此，檢測手術(shù)NSCLC標(biāo)本瘤內(nèi)ERCC1表達(dá)，對預(yù)后評估有一定的指導(dǎo)價(jià)值，可作為NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo)。

［1］Ceppi P，Volante M.ERCC1 and RRM1 gene expressions but not EGFR are predictive of shorter survival in advanced Non-small-cel lung cancer treated with cisplatin and gemcitabine［J］.Ann Oncol，2006，17(12):1819-1823.

［2］Wachters FM，Wong LS，Timens W.ERCC1，hRad51，and BRCA1 protein expression in relation to tumour response and survival of stage Ⅲ/Ⅳ NSCLC patients treated with chemotherapy［J］.Lung Cancer，2005，50(2):211-217.

［3］Kalikaki A，Kanaki M，Vassalou H，et al.DNA repair gene polymorphisms predict favorable clinical outcome in advanced non-smallcell lung cancer［J］.Clin Lung Cancer，2009，10(2):118-123.

［4］Rosell R，F(xiàn)eliP E，Maestre J.The role of chemotherapy in early nonsmall cell lung cancer management［J］.Lung Cancer，2001，34(13):63-74.

［5］Ota S，Ishii G，Goto K.Immunohistochemical expression of BCRP and ERCC1 in biopsy specimen predicts survival in advanced nonsmall-cell lung cancer treated with cisplatin-based chemotherapy［J］.Lung Cancer，2009，64(1):89-104.

［6］Azuma K，Sasada T.Expression of ERCC1 and classⅢ beta-tubulin in non-small cell lung cancer patients treated with carboplatin and paclitaxel［J］.Lung Cancer，2009，64(3):326-333.

［7］Gandara DR，Kawaguchi T，Crowley J，et al.Japanese-US commonarm analysis of paclitaxel plus carboplatin in advanced non-smallcell lung cancer:a model for assessing population-related pharmacogenomics［J］.Clin Oncol，2009，27(21):3540-3546.

［8］Su D，Ma S.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2007，56(2):281-288.