紅細(xì)胞生成素對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響

鄧英輝，付文靜，張 沛

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腎內(nèi)科，北京100053)

紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種主要由腎臟分泌產(chǎn)生的活性糖蛋白，作用于骨髓中的紅系祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化。臨床主要用于慢性腎功能不全及腫瘤化療相關(guān)貧血的治療。近年來的研究顯示，EPO尚具有抗炎性反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用，在急性腎損傷病理過程中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［1，2］，而對(duì)慢性腎臟病理過程是否具有保護(hù)作用尚存爭議。有觀察顯示，EPO可以減緩慢性腎小管間質(zhì)性腎炎的病理過程，減輕慢性腎間質(zhì)纖維化病變程度［3，4］。但也有研究認(rèn)為，EPO可加重慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展［5］。本研究采用單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型為研究對(duì)象，觀察EPO對(duì)慢性間質(zhì)性腎炎及間質(zhì)纖維化病理過程的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立及分組 清潔級(jí)雌性SD大鼠 36只，體質(zhì)量 250～300 g，隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組)、模型組(UUO手術(shù)組)和EPO治療組(UUO+EPO治療組)，每組各12只大鼠。其中模型組及治療組行單側(cè)輸尿管梗阻術(shù):戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉大鼠，行腹正中切口，逐層打開至腹膜后，游離左側(cè)輸尿管，在輸尿管中上1/3處行雙重徹底結(jié)扎，于兩處結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷輸尿管。然后逐層縫合，清潔傷口，建立UUO動(dòng)物模型。假手術(shù)組僅行單側(cè)輸尿管游離，但不結(jié)扎，余處理方法相同。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法 EPO治療組在手術(shù)前1天及術(shù)后第2、5、8天給予EPO(重組人促紅細(xì)胞生成素注射液，沈陽三生制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn))腹腔注射(1000 U/kg)。對(duì)照組及模型組以等體積的注射用水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食水。

1.2.2 病理變化 術(shù)后第10天處死大鼠，取術(shù)側(cè)腎組織，10%甲醛溶液固定。常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木素-伊紅和過碘酸雪夫染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病變程度，并測(cè)量皮質(zhì)相對(duì)間質(zhì)容積。

1.2.3 腎皮質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子β1、α平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原表達(dá)的測(cè)定 免疫組化方法檢測(cè)腎皮質(zhì)轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原的表達(dá)。采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法。載玻片應(yīng)用 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷防脫片處理，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，以新鮮配制的3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后滴加復(fù)合消化液37℃消化1 h。滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min后，分別滴加不同的一抗，37℃孵育1 h，再滴加生物素化山羊抗小鼠或抗兔IgG，37℃孵育30 min后滴加鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物復(fù)合物，室溫下孵育30 min。最后加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間。蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。試驗(yàn)同時(shí)采用磷酸鹽緩沖液替代一抗的方法作為陰性對(duì)照。一抗分別為兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(中山生物公司)，兔抗大鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體(博士德生物公司)。

1.2.4 觀察指標(biāo)的半定量分析 采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(HPIAS1000型)進(jìn)行觀察指標(biāo)的半定量分析。過碘酸雪夫染色切片在高倍鏡(200×)下隨機(jī)選擇10個(gè)腎臟皮質(zhì)視野，測(cè)定腎間質(zhì)面積占視野面積的百分比為相對(duì)間質(zhì)容積值。同樣，免疫組化染色切片于高倍鏡下(200×)觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)腎臟皮質(zhì)視野，測(cè)定陽性染色面積占視野面積的百分比。視野面積中去除腎小球及大血管面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小管間質(zhì)病理變化 顯微鏡下觀察組織切片，UUO術(shù)后第10天，大鼠腎臟出現(xiàn)明顯的腎小管間質(zhì)炎癥及間質(zhì)纖維化病理改變，表現(xiàn)部分腎小管呈不同程度的擴(kuò)張，上皮細(xì)胞水腫、變性、壞死，小管基底膜出現(xiàn)不同程度的斷裂、增厚，小管間質(zhì)區(qū)域面積擴(kuò)大，部分腎小管甚至出現(xiàn)萎縮、壞死。小管間質(zhì)可見大量單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤，纖維化程度較為明顯。腎小球變化則較不明顯。對(duì)照組腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密、整齊，小管基底膜光滑、連續(xù)，小管間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤。腎臟皮質(zhì)相對(duì)間質(zhì)容積測(cè)定顯示:對(duì)照組為(12.14±1.61)%，模型組為(27.72 ±2.94)%，治療組為(22.11 ±2.62)%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=152.917，P＜0.01)，模型組和治療組的間質(zhì)容積較對(duì)照組增加(P ＜0.01)，但治療組低于模型組(P ＜0.01)。

2.2 腎小管間質(zhì) TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)的變化 ①TGF-β1染色:對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量TGF-β1陽性染色，為顆粒狀，主要在近曲小管內(nèi)。模型組與治療組TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯增多(與對(duì)照組比較，P＜0.01)，呈不均勻顆粒狀。治療組與模型組比較則明顯減弱(P＜0.01)，見圖1。②α-SMA 染色:對(duì)照組腎臟組織中α-SMA主要在血管壁上表達(dá)，小球和小管細(xì)胞中較少見陽性染色。模型組和治療組除血管壁上有表達(dá)外，尚可大量見于腎間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中，同時(shí)部分小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)明顯的陽性染色顆粒。模型組和治療組與對(duì)照組比較α-SMA染色顯著增加(P ＜0.01)，但治療組明顯少于模型組(P ＜0.01)，見圖2。③Ⅰ型膠原染色:對(duì)照組中，Ⅰ型膠原只在腎間質(zhì)中有少量表達(dá)。模型組和治療組Ⅰ型膠原在腎間質(zhì)中沉積明顯多于對(duì)照組(P＜0.01)，但治療組較模型組明顯減少(P＜0.01)，見圖3、表1。

圖1 各組大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(dá)(免疫組化染色，光鏡200×)

圖2 各組大鼠腎臟組織α-SMA的表達(dá)(免疫組化染色，光鏡200×)

圖3 各組大鼠腎臟組織Ⅰ型膠原的表達(dá)(免疫組化染色，光鏡200×)

表1 各組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原免疫組化半定量分析

3 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EPO可作用于多種類型的細(xì)胞，具有維持細(xì)胞生存、促進(jìn)細(xì)胞生長的作用。人和嚙齒類動(dòng)物腎臟的腎小球細(xì)胞、系膜細(xì)胞及腎小管細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有EPO受體存在［1］。在急性腎功能不全動(dòng)物模型中的觀察顯示，EPO具有減緩系統(tǒng)炎性反應(yīng)、減輕腎小管損傷、抑制小管細(xì)胞凋亡和壞死、促進(jìn)腎小管再生等腎臟保護(hù)作用，并且這種腎臟保護(hù)作用不依賴于EPO對(duì)貧血的糾正及對(duì)組織缺氧的改善［1，2］。EPO在慢性腎間質(zhì)纖維化病理過程中是否具有腎臟保護(hù)作用尚存爭議。有研究顯示，在慢性間質(zhì)性腎炎動(dòng)物模型中，EPO可抑制炎性細(xì)胞浸潤、減少細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白沉積、減輕腎間質(zhì)纖維化程度，具有抗炎癥及抗纖維化作用［3，4］。但也有觀察認(rèn)為，EPO可加重慢性間質(zhì)性腎炎的炎性反應(yīng)和小管損傷程度，促進(jìn)小管萎縮及間質(zhì)纖維化的發(fā)展［5］。

慢性腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期的共同途徑。TGF-β1是最重要的促纖維化因子，在腎間質(zhì)纖維化過程的多個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮作用。TGF-β1主要由活化的腎小管上皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞分泌。促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是TGF-β1的重要作用之一，也是慢性腎間質(zhì)纖維化病理過程的重要分子機(jī)制，其主要特征是腎小管上皮細(xì)胞失去其原有的細(xì)胞表型(如角蛋白、E-鈣黏蛋白等)，表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表型，如α-SMA。表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力顯著增加。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。腎小管間質(zhì)區(qū)域的膠原蛋白以Ⅰ、Ⅲ型膠原多見，主要來源于肌成纖維細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)的異常合成和堆積是腎間質(zhì)纖維化的主要病理特征之一。

UUO模型是經(jīng)典的慢性腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。在UUO大鼠模型中觀察到，UUO術(shù)后第10天，患側(cè)腎臟出現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化病理變化，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤，小管擴(kuò)張、萎縮、壞死，細(xì)胞外基質(zhì)及膠原含量增加，間質(zhì)容積擴(kuò)大。EPO處理后上述變化則顯著減輕，提示EPO具有明確的抗間質(zhì)纖維化作用。在UUO模型組，TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯升高，與間質(zhì)纖維化程度相符。TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，以近曲小管為主。α-SMA可見于部分腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。這種改變提示病理狀態(tài)下部分腎小管上皮細(xì)胞活化，分泌TGF-β1增加;同時(shí)部分腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)而分泌膠原蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)間質(zhì)纖維化的發(fā)展。EPO則可以顯著抑制 TGF-β1及α-SMA的表達(dá)、減少膠原合成，改善腎間質(zhì)纖維化的程度。國外研究也顯示相同的結(jié)果。如 Srisawat等［6］及 Park 等［7］學(xué)者的研究分別觀察到，EPO可明顯減緩UUO大鼠及小鼠腎臟的間質(zhì)性腎炎及間質(zhì)纖維化程度，具有明確的抗腎間質(zhì)纖維化作用。EPO可抑制腎臟局部TGF-β1分泌和 α-SMA的表達(dá)，抑制腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減少膠原蛋白的分泌，進(jìn)而減輕腎間質(zhì)纖維化程度。De Beuf等［3］學(xué)者的研究顯示，在5/6腎臟切除的慢性腎功能不全大鼠模型中，EPO可明顯減輕腎間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤，減少膠原合成，抑制腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。這與EPO抑制TGF-β1分泌、抑制其促纖維化作用有關(guān);且EPO對(duì)TGF-β1分泌的抑制作用呈劑量依賴性。EPO發(fā)揮這種腎臟保護(hù)作用的劑量低于糾正貧血所需劑量，提示其腎臟保護(hù)作用不依賴于對(duì)貧血的糾正作用。體外培養(yǎng)的近端腎小管上皮細(xì)胞的研究也顯示，EPO可抑制TGF-β1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡及腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［7，8］。這進(jìn)一步提示EPO具有腎臟保護(hù)作用，且這種作用并不依賴于EPO對(duì)貧血的改善。

結(jié)合該研究和其他學(xué)者的研究顯示，EPO具有明確的抗腎間質(zhì)纖維化作用，這種腎臟保護(hù)作用部分是通過EPO抑制腎小管上皮細(xì)胞活化和TGF-β1表達(dá)，阻止腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化完成的。關(guān)于EPO抗腎間質(zhì)纖維化的詳細(xì)作用機(jī)制及對(duì)臨床實(shí)踐的意義尚需進(jìn)一步研究。

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