不同品系小鼠在三種常見(jiàn)抑郁檢測(cè)方法中的行為學(xué)表現(xiàn)

李騰飛，孫秀萍，石 哲，高江暉，劉新民，劉華鋼

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250355）

本實(shí)驗(yàn)選用常用的4種品系小鼠（C57BL/6、BALB/c、ICR和昆明）進(jìn)行了三種行為學(xué)檢測(cè)，以期為急性應(yīng)激抑郁模型的品系選擇提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

空?qǐng)鲇?jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng)、懸尾計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng)均由中國(guó)航天員訓(xùn)練中心和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所聯(lián)合研制開(kāi)發(fā)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6、BALB/c、ICR和昆明小鼠各12只，SPF級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK（軍）2007-004】。4種小鼠均為雄性，健康，體重20～24 g，在塑料籠中分籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)房間（24～26）℃，采用12 h明，12 h暗循環(huán)照明，室內(nèi)環(huán)境安靜，小鼠自由獲得水和食物。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)（本實(shí)驗(yàn)遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)

用空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)（open field test）［1］觀察小鼠進(jìn)入新環(huán)境的自發(fā)活動(dòng)特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用空?qǐng)鲇?jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。該空?qǐng)鰷y(cè)試箱為4個(gè)相同大小的具有一定斜度的桶組成，桶底面直徑30 cm，上口直徑34 cm，高40 cm。將4個(gè)圓桶置于封閉的空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)測(cè)試箱（80×80×150）cm中，測(cè)試箱內(nèi)部頂端安置兩組照明燈，內(nèi)部的光照強(qiáng)度為120 Lux，并且在測(cè)試箱頂部有內(nèi)置攝像頭，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的活動(dòng)狀態(tài)并將動(dòng)物的行為信息采集輸送至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)［2］。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將小鼠放入空?qǐng)龌顒?dòng)測(cè)試箱的4個(gè)圓桶（桶內(nèi)中央半徑為7.5 cm的區(qū)域劃分為中央?yún)^(qū)）中，選擇空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)計(jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)檢測(cè)分析系統(tǒng)中的抗抑郁模式，完成實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置，將實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置為30 min，進(jìn)行亮度、幾何和照度標(biāo)定后，選擇文件存貯路徑以保存實(shí)驗(yàn)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鍵入開(kāi)始命令后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、平均速度、中央?yún)^(qū)的路程比率和時(shí)間比率等6個(gè)指標(biāo)。同時(shí)人工記錄小鼠剛放進(jìn)測(cè)試箱中5 min內(nèi)的直立次數(shù)（動(dòng)物雙前肢同時(shí)離地，或者雙前肢放在桶壁上算作直立一次）。

2.2 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)

懸尾實(shí)驗(yàn)基于Steru等［3］建立的方法。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尾部固定，使其頭部向下懸掛，動(dòng)物在該環(huán)境中拼命掙扎，企圖擺脫困境，在經(jīng)過(guò)努力仍不能擺脫后，出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示“行為絕望”狀態(tài)。該實(shí)驗(yàn)采用懸尾計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)檢測(cè)分析處理系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試。懸尾箱（72×36×16）cm采取四周封閉，頂面開(kāi)放的形式，被分割成8個(gè)單元（18×18×16） cm，可以同時(shí)檢測(cè)8只動(dòng)物。懸尾桿上固定著張力傳感器，其高度可通過(guò)與其相連的主桿旋鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)操作需求。實(shí)驗(yàn)步驟如下：打開(kāi)懸尾采集分析軟件，完成實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置，將實(shí)驗(yàn)時(shí)間設(shè)置于6 min，選擇文件存貯路徑以保存實(shí)驗(yàn)參數(shù)；用膠布分別將8只小鼠尾端（約1 cm處）和特制小鉤對(duì)折粘在一起（小鼠呈倒懸體位且頭部距離箱底約5 cm），同時(shí)掛在懸尾箱上各自的張力傳感器上，立即鍵入開(kāi)始命令后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄6 min內(nèi)小鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

2.3 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

此實(shí)驗(yàn)在Porsolt等人［4］建立的方法上做了一些改進(jìn)。將動(dòng)物單獨(dú)地放在柱狀塑料桶中（水深15 cm，直徑20 cm），水溫（25±1）℃。強(qiáng)迫游泳6 min，用秒表記錄后4 min內(nèi)小鼠的累積不動(dòng)時(shí)間。（不動(dòng)即“小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，四肢有輕微動(dòng)作以保持頭部在水面”）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，各組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)和單因素方差分析判斷其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與C57BL/6小鼠相比較，BALB/c、ICR和昆明小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均速度、直立次數(shù)、中央?yún)^(qū)的路程比率和時(shí)間比率這5個(gè)指標(biāo)均表現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05）。BALB/c、ICR和昆明小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均速度和直立次數(shù)顯著性高于C57BL/6小鼠。C57BL/6小鼠在中央?yún)^(qū)的運(yùn)動(dòng)路程、路程比率和時(shí)間比率也低于其他3種品系，并且與其他3種品系小鼠相比表現(xiàn)出差異顯著性（P＜0.05）。ICR和昆明小鼠在運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均速度和直立次數(shù)這4個(gè)指標(biāo)上也明顯高于BALB/c小鼠（P＜0.05），但是ICR和昆明小鼠的運(yùn)動(dòng)總路程、運(yùn)動(dòng)總時(shí)間、平均速度和直立次數(shù)這四個(gè)指標(biāo)卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1和圖1）。

表1 四種不同品系小鼠自主活動(dòng)的結(jié)果Tab.1 Results of open field test in the four species ofmice

3.2 懸尾實(shí)驗(yàn)

圖1 四種不同品系小鼠的直立次數(shù)注：與C57BL/6比較，P＜0.05，＊＊P＜0.01：與BALB/c比較，#＜0.05，##P＜0.01。Fig.1 Number of rearing in the four species ofmiceNote：* P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with C57BL/6 mice；#＜0.05，##P＜0.01，compared with BALB/c mice.

C57BL/6小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間明顯高于BALB/c、ICR和昆明小鼠（P＜0.05），在與其他3種品系小鼠相比懸尾不動(dòng)時(shí)間表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。BALB/c、ICR和昆明小鼠之間的懸尾不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性（圖2）。

3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

與小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同的是，4種品系小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異。但是C57BL/6小鼠不動(dòng)時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差比其他3種品系小鼠小，同時(shí)它的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間也略高于其他3種品系小鼠（圖3）。

4 討論

圖2 四種不同品系小鼠的懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：與C57BL/6比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01：與BALB/c比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Fig.2 Results of tail suspension test in thefour species ofmiceNote：* P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with C57BL/6 mice； #P ＜0.05，##P＜0.01，compared with BALB/c mice.

圖3 四種不同品系小鼠的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Results f forced swimming tests in the four species ofmice

實(shí)驗(yàn)小鼠在人類(lèi)漫長(zhǎng)的培育過(guò)程中已分化為多個(gè)品系如Swiss、ICR、DBA/2、BALB/c、C57BL/ 6［5］。其中C57BL/6和BALB/c小鼠是科學(xué)研究中常用而遺傳背景差異較大的兩個(gè)近交系［6］；ICR小鼠是國(guó)際著名的遠(yuǎn)交群品系，其群體內(nèi)個(gè)體差異和在某些位點(diǎn)上的多態(tài)性非常符合遠(yuǎn)交群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特點(diǎn)；而昆明小鼠一直是我國(guó)特有的并且使用量最大的遠(yuǎn)交群小鼠［7］。本實(shí)驗(yàn)選用三種國(guó)際上常用的抑郁檢測(cè)方法對(duì)這四種品系小鼠進(jìn)行行為學(xué)比較研究，以探討各自的行為特征。

空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)是在固定的區(qū)域內(nèi)對(duì)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)指標(biāo)進(jìn)行觀察記錄，相對(duì)于操作性條件反射和急性應(yīng)激刺激，空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的影響最小，通常用于判斷動(dòng)物的興奮或抑郁狀態(tài)，在鎮(zhèn)靜、抑郁和焦慮等神經(jīng)精神藥理研究領(lǐng)域內(nèi)廣泛運(yùn)用［1］。本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)圖像實(shí)時(shí)分析檢測(cè)技術(shù)，動(dòng)態(tài)分析動(dòng)物在空?qǐng)鲋械幕顒?dòng)軌跡，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)，擺脫了主觀的人工觀察方法，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠［2］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C57BL/6小鼠在空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)（運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間）顯著低于其他3種品系的小鼠，水平運(yùn)動(dòng)少反映了動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)量低。由于嚙齒類(lèi)動(dòng)物有喜好靠邊活動(dòng)的特性，中央?yún)^(qū)域?qū)儆诓黄珢?ài)的區(qū)域，中央?yún)^(qū)域活動(dòng)頻率可以評(píng)價(jià)小鼠的探究行為［8］。在本實(shí)驗(yàn)中C57BL/6小鼠在中央?yún)^(qū)的路程比率和時(shí)間比率均低于其他三種品系小鼠；另外，Edsbagge等［9］曾經(jīng)將直立行為也作為評(píng)價(jià)小鼠探索行為的指標(biāo)，C57BL/6小鼠的直立次數(shù)顯著低于ICR和昆明小鼠（P＜0.01），但是略高于BALB/c小鼠。鑒于此，為了避免單一指標(biāo)的局限，本實(shí)驗(yàn)將中央?yún)^(qū)域活動(dòng)頻率和直立行為進(jìn)行綜合分析，從而說(shuō)明C57BL/6小鼠對(duì)新奇環(huán)境的探索能力差。

小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是通過(guò)對(duì)動(dòng)物施以無(wú)法逃避的應(yīng)激刺激造成動(dòng)物的行為絕望（behavioral despair）而模擬人類(lèi)的抑郁癥癥狀［10］，在行為藥理實(shí)驗(yàn)中常用于抗抑郁藥物的快速篩選。在這兩種實(shí)驗(yàn)中，小鼠最初表現(xiàn)為掙扎、試圖逃脫，一段時(shí)間過(guò)后小鼠放棄掙扎呈顯不動(dòng)狀態(tài)，這反應(yīng)了小鼠“無(wú)助”的癥狀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在這4種品系中C57BL/6小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間最長(zhǎng)，與BALB/c、ICR和昆明小鼠相比差異表現(xiàn)出顯著性（P＜0.05），但是在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中四種品系小鼠的不動(dòng)時(shí)間差異無(wú)顯著性，對(duì)上述結(jié)果綜合分析表明了C57BL/6小鼠在無(wú)法逃避的應(yīng)激刺激下易于造成行為絕望，其病理和生理機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)中近交系C57BL/6小鼠的自發(fā)活動(dòng)量低，對(duì)新奇環(huán)境的探索能力差，在急性應(yīng)激刺激下容易造成行為絕望，因此C57BL/6小鼠可能更適合用于急性應(yīng)激抑郁模型。

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