不同廠家紅霉素軟膏微生物限度檢查方法驗證研究

李傳響

不同廠家紅霉素軟膏微生物限度檢查方法驗證研究

李傳響

目的建立紅霉素軟膏的微生物限度檢查方法。方法 人為加入5種陽性對照菌，測定其回收率。結果根據(jù)回收率試驗結果，判定紅霉素軟膏對細菌的抑菌作用的強弱。結論必需采用離心集菌薄膜過濾法才能清除樣品的抑菌作用，該法可用于紅霉素軟膏的微生物限度的檢查。

紅霉素軟膏;微生物限度;回收率

(如金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌等)，對衣原體等也有抑菌作用。筆者在反復驗證多個廠家紅霉素軟膏微生物限度檢查方法時，發(fā)現(xiàn)常規(guī)法，培養(yǎng)基稀釋法均不適用于該制劑的微生物限度檢查，而離心集菌薄膜過濾法均可適用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 HTY-601型集菌儀(杭州泰林醫(yī)療機械廠);紅霉素軟膏(6個廠家分別編號為S1～S6);大腸埃希菌;枯草芽孢桿菌;金黃色葡萄球菌;銅綠假單胞菌;白色念珠菌;黑曲霉菌種均系中國藥品生物制品檢定所提供。營養(yǎng)瓊脂，玻瑰紅鈉瓊脂，膽鹽乳糖，pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨等培養(yǎng)基均系牛?；蛏锕旧a。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液：取上述菌種的新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10 ml中，經35℃培養(yǎng)24 h，再將上述各菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍級分別稀釋至10-7、10-5、10-7，10-6，使以上各菌含菌量約為 50 ～ 100 cfu/ml，備用。

1.2.2 白色念珠菌液 取該菌種新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，經25℃ 培養(yǎng)36 h，再取該菌液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-5，備用。

1.2.3 黑曲霉 取黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃ 培養(yǎng)7 d，再取該斜面培養(yǎng)物，加4 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸取孢子懸液1 ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋，用標準比濁管比濁，濁度相當后，取1 ml稀釋后的孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-4，備用。上述各株菌的培養(yǎng)物均為第3代的培養(yǎng)物。

1.2.4 供試液制備 參照關資料文獻［1～6］的方法，取本品10g，加無菌十四烷酸異丙酯20 ml及玻璃珠，充分振搖，分散均勻，再加入0.9%無菌氯化鈉溶液至100 ml，充分振搖，萃取，置8℃環(huán)境中靜置分層，取下層部分作為供試液。

1.2.5 回收率測定 試驗組(A組)：取供試液1 ml和試驗菌液1 ml，注入平皿，立即傾注相應的培養(yǎng)基，平行制備2皿，依法測定其菌落數(shù)［1］。培養(yǎng)基稀釋法：取供試液1 ml，分注5個平皿中，使成0.2 ml/皿;取供試液1 ml，分注2個平皿中，使成0.5 ml/皿，再依次加入試驗菌。離心集菌薄膜過濾法：取供試液1 ml，加入200 ml稀釋液中混合均勻后，經薄膜過濾并沖洗，沖洗量分別為200、400、500、600、800 ml，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，濾干，取出薄膜貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上。菌液組(B組)：依法測定;供試品組(C組)：取規(guī)定量的供試液，除不加陽性菌外，依法測定;稀釋劑對照組(D組)：用相應的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，依法測定。

1.2.6 檢查方法確定 常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法：先挑選金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌作為試驗菌。采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法分別進行回收率試驗，再據(jù)預測結果，確定計數(shù)方法并進行全菌種驗證。薄膜過濾法［7］：經薄膜過濾法，用600 ml沖洗液沖洗后，進行菌落計數(shù)及回收率測定。

1.2.7 檢查方法驗證 取不同廠家的樣品，按確定的方法對5株實驗菌進行回收率試驗。

1.2.8 控制菌檢查方法確立與驗證 外用消炎制劑，都不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，故以此二菌為驗證菌株，以大腸埃希菌為陰性對照菌。分別作為試驗組和對照組。試驗組取供試液10 ml，加入適量的培養(yǎng)基中，按藥典附錄下的金黃色葡萄球菌進行檢查，應檢出該菌株。采用低速離心集菌薄膜過濾法時，取適量供試液，500r/min的轉速進行離心5 min，取上清液10 ml，加至稀釋液200 ml中混合均勻，經薄膜過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入驗證菌株，再加入相應的增菌液100 ml，按規(guī)定培養(yǎng)。陰性菌對照組，不得檢出。依次采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、離心薄膜過濾法。

2 結果

2.1 方法預試驗結果見表1?？梢姌悠穼毦忻黠@抑制作用，對真菌無抑制作用。因此，不可用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進行細菌計數(shù)，但常規(guī)方法適用于霉菌及酵母菌計數(shù)檢查。薄膜過濾法預試結果顯示，細菌的回收率都高于70%以上［8］。因此可確定用薄膜過濾法進行細菌計數(shù)檢查，用常規(guī)法進行霉菌及酵母菌的計數(shù)檢查。

表1 常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法回收率預試驗結果(%)

2.2 方法驗證結果見表2。結果顯示3次平行度驗證的回收率均達到了70%以上，說明所用方法符合2005年版中國藥典的規(guī)定。

表2 不同廠家的樣品驗證試驗結果

2.3 依據(jù)控制菌檢查方法驗證后，結果表明，金葡菌和銅綠菌以低速離心集菌薄膜過濾法，沖洗量以400 ml最佳沖洗量，能夠有效去除該類藥品的抑菌活性。

3 討論

紅霉素軟膏對真菌幾乎無抑制作用，因此可用常規(guī)方法進行霉菌及酵母菌檢查。但對細菌有很強的抑制作用，但細菌檢查以低速離心集菌薄膜過濾法，沖洗量600 ml/膜最佳。控制菌檢查，采用低速離心集菌薄膜過濾法，以400 ml沖洗量為宜。薄膜過濾法時，沖洗量宜采用少量多次的梯度沖洗法，有利于供試液中微生物的回收，并先加入到一定量的稀釋液中，有助于細菌分散均勻，益于過濾。因驗證工作量大，為盡快掌握驗證方法，先以少數(shù)敏感菌進行預試驗，可以快速找準檢測方法。紅霉素軟膏的基質全是油包水型的，不易溶解于水中，因此加入無菌十四烷酸異丙酯，無菌的玻璃珠振搖，可以有效地溶解軟膏，分散均勻，同時置于8℃以下的環(huán)境中靜置分層，有利于將水層分離出來做為供試液。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部).北京：化學工業(yè)出版社，2005;附錄XIH：附錄89-98

［2］ 于榮，李海妮，邢俊生.諾氟沙星軟膏微生物限度檢查方法的建立和驗證.中國藥物與臨床，2009，9(9)：831-833

［3］ 陸益萍.3種軟膏劑的微生物限度檢查驗證.安徽醫(yī)藥，2008，12(4)：318-319.

［4］ 馬曉璇，李汶，溫玉瑩.2種含硫磺制劑的微生物限度檢查方法驗證.今日藥學，2009，19(2)：50-51.

［5］ 袁林娜.苗藥膚痔清軟膏微生物限度檢查方法驗證試驗研究.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2007，(3)：171-173.

［6］ 吳曉敏，王燕燕.8種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗證.中國醫(yī)院藥學雜，2007，27(1)：93-94.

［7］ 宋勤，杜平華.中成藥微生物限度檢查法的探討.中國藥事，2006，20(1)：46-48.

［8］ 李秋菲，唐振宏，張芹，等.4種大環(huán)內酯類藥物微生物限度檢查方法驗證.中國藥業(yè)，2008，17(13)：20-21.

Method Validation of microbial limit Test for erythromycin oiintment

LI Chuan-xiang.Anqing Institute for Food and Drug Control，Anqing 246001，China

ObjectiveTo establish the microbial limit test method for Erythromycin Ointment.MethodsThe antimicrobial effect of Erythromycin Ointment was determined by recovery rate with 5 control strains.ResultsAccording to theResultsof the recovery rate test.Erythromycin Ointment had higher antimicrobial effects.ConclusionThe antimicrobial effect must be eliminated by centrifugation and membrane filtration.The method can be used to the microbial limit test for Erythromycin Ointment.

Erythromycin Ointment;microbial limit;Recovery rate根據(jù)2005年版中國藥典規(guī)定微生物限度檢查應進行驗證。紅霉素屬于大環(huán)內酯類的抗生素，對革蘭氏陽性微生物

246001安慶市食品藥品檢驗所

·論著·