鹽酸氮卓斯汀滴眼液無菌檢查方法學驗證研究

李旸華 張映娜 雷柳冰 林秋鳳

鹽酸氮卓斯汀滴眼液無菌檢查方法學驗證研究

李旸華 張映娜 雷柳冰 林秋鳳

目的確定可行的鹽酸氮卓斯汀滴眼液無菌檢查方法。方法 采用薄膜過濾法對樣品進行無菌檢查。結果樣品、陰性對照及試驗組菌生長良好。結論薄膜過濾加緩沖液沖洗能去除抑菌作用，并通過驗證試驗保證無菌檢查方法的可靠性。

鹽酸氮卓斯汀滴眼液;無菌檢查方法;方法驗證

鹽酸氮卓斯汀為一種新結構的2、3二氮雜萘酮的衍生物，為潛在的長效抗過敏化合物，具有H1受體拮抗劑特點。為確保用藥安全，《中國藥典》2010版規(guī)定所有眼用制劑均要求進行無菌檢查。但在《中國藥典》2005版只要求微生物限度檢查，為確保方法的可行性和結果的準確性，在建立鹽酸氮卓斯汀滴眼液無菌檢查方法時，進行試驗菌的驗證，證明所用的方法能有效地去除抑菌活性。適合該滴眼液的無菌檢查。

1 儀器與試藥及菌種

智能集菌儀(天津羅根科技有限公司)、一次性全封閉集菌器(杭州泰林生物技術設備有限公司)、全自動高壓消毒鍋(日本三洋);鹽酸氮卓斯汀滴眼液由眾生藥業(yè)生產，生產批號為101001、101102、101101.規(guī)格：0.05%;菌種均來自中國藥品生物制品檢驗所：金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10 104］、大腸埃希菌［CMCC(B)10 102］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63 501］、生孢梭菌［CMCC(B)64 941］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］;培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、0.1%的無菌蛋白胨水。聚山梨酯80、氯化鈉。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30℃ ～35℃培養(yǎng)18～24 h;接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃ ～35℃培養(yǎng)18～24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23℃～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)＜100cfu(菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23℃～28℃培養(yǎng)7 d，加入3～5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液(用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細吸管［1］)至無菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。備用。具體所用菌液的稀釋級及菌落數(shù)見表1。

2.2 培養(yǎng)基適用性檢查

2.2.1 無菌性檢查 取上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基各制備成滅菌溶液，在相應條件下培養(yǎng)14 d，結果為無菌生長。

2.2.2 靈敏度檢查 取每管裝量為12 mI 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種＜100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3 d;取每管裝量為9 mI的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種＜100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5 d，逐日觀察結果。結果：空白對照管無菌生長，加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，靈敏度檢查符合規(guī)定［2］見表 2。

2.3 方法的選擇及方法驗證試驗

2.3.1 直接薄膜過濾法 將供試品5瓶按薄膜過濾法過濾(每種試驗菌的樣品量)后。采用薄膜過濾法過濾，接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基，同時加入小于100cfu的試驗菌。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d。各試驗菌同法操作，并分別做陰性對照80 ml。結果見表3。

表2 培養(yǎng)基靈敏度檢查

表3 溶解后直接過濾的試驗結果

從上表可知，供試品對金黃色葡萄球菌、生孢梭菌有抑菌作用，所以不能用直接薄膜過濾法。

2.3.2 薄膜過濾法加沖洗 將供試品5瓶采用薄膜過濾法過濾(每種試驗菌的樣品量)后，用0.1%蛋白胨水150 ml分3次沖洗，接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基，同時加入小于100cfu的試驗菌。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d。結果見表4。

表4 薄膜過濾法加沖洗試驗結果

2.3.3 結論 表2顯示，試驗組與陽性對照組中試驗菌細菌均在1 d內生長良好，試驗菌真菌均在3 d內生長良好符合驗證要求，則本品采用以下方法進行無菌檢查：取供試品15瓶，消毒瓶外壁后，采用薄膜過濾法(一次性全封閉)，集菌器，三筒/聯(lián))過濾后，用0.1%蛋白胨水450 ml分三次沖洗，每次150 ml，于兩筒中加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，一筒加入改良馬丁培養(yǎng)基，以金黃色葡萄球菌為陽性菌，按規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d，逐日觀察結果。

3 討論

3.1 實驗先將過濾前用沖洗液濕潤濾膜，可減少沖洗量。

3.2 樣品組及空白對照組的設置，目的在于保證實驗在樣品、溶劑、沖洗液、培養(yǎng)基及相關實驗器材均為無菌的情況下進行，避免上述因素對實驗結果造成干擾［3］。

3.3 鹽酸氮卓斯汀對金黃色葡萄球菌和生孢梭菌有抑制作用，特別是金黃色葡萄球菌，驗證實驗表明，采用薄膜過濾法，沖洗量為450 ml，此法簡單有效方便可行。

［1］ 中國藥品檢驗標準操作規(guī)范.2005年版.北京：國醫(yī)藥科技出版社，2005：313-32

［2］ 國家藥典委員會.《中國藥典》2010年版.二部.北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄103-107.

［3］ 蘇德膜，馬旭榮.藥品微生物學檢驗技術.北京：華齡出版社，2007：1.

Studies on test for sterility of azelastine hydrochloride eye drops

LI Yang-hua，ZHANG Ying-na，LEI Luibing，et al.Institute for Food And Drug Control of Dongguan，GuangDong，523109，China

ObjectiveTo establish a method for slerility test of azelastine hydrochloride eye drops.MethodsUsing membrane filtration method for sterility test of samples.ResultsThe samples，negative control samples and the growth of good bacteria.ConclusionAdd buffer to wash the membrane filter to remove the inhibitory effect，and through verification tests to ensure the reliability of sterility test method.

Azelastine hydrochloride eye drops;sterility test method;method validation

523109東莞市食品藥品檢驗所