HPV16/18在泰興地區(qū)食管鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

周萍，王修珍，朱正龍，劉靜，李霞

（1.揚(yáng)州大學(xué)附屬江蘇省泰興市人民醫(yī)院病理科，江蘇 泰興 225400；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江蘇 蘇州 215123）

HPV16/18在泰興地區(qū)食管鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

周萍1，王修珍2，朱正龍1，劉靜1，李霞1

（1.揚(yáng)州大學(xué)附屬江蘇省泰興市人民醫(yī)院病理科，江蘇 泰興 225400；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江蘇 蘇州 215123）

目的探討人乳頭狀瘤病毒16/18（HPV16/18）在食管鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性。方法 應(yīng)用雙探針原位雜交檢測(cè)HPV16/18在72例食管鱗癌，18例正常食管黏膜，12例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，18例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)并分析其與食管鱗癌的關(guān)系。結(jié)果 食管鱗癌HPV16/18陽(yáng)性率為55.56%（40/72）。正常食管上皮、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變HPV16/18陽(yáng)性率均明顯低于食管鱗癌，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)論HPV16/18與食管鱗癌的臨床分期、病理分級(jí)、組織大體形態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡、浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)性，與食管的鱗狀上皮惡變有一定相關(guān)性，可為食管鱗癌病因預(yù)防治療提供依據(jù)。

HPV16/18；雙探針；原位雜交；食管鱗形細(xì)胞癌

食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。食管癌是發(fā)病率變異最大的疾病之一，高發(fā)區(qū)和低發(fā)區(qū)相差可達(dá)60倍［1］。蘇北地區(qū)已成為主要的高病死率水平地區(qū)。2007-2008年兩年間江蘇省泰興人民醫(yī)院胸外科食管腫瘤住院病人就達(dá)750例。

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPVs）與食管癌關(guān)系的研究是從 Syrjanen 等［2，3］于 1982年首次提出并證實(shí)食管癌組織存在有HPVs感染以后開(kāi)始的。到目前為止，在食管癌組織中檢測(cè)到的已知 HPV 型別有 HPV6、11、16、18、30、31/33/35，其中以HPV16和18最為常見(jiàn)。許多學(xué)者研究了HPVs與食管癌的關(guān)系，但結(jié)論不一，不同地區(qū)食管癌HPVs感染率從0%至100%不等，文獻(xiàn)報(bào)道食管癌高發(fā)區(qū)HPVs感染率高于低發(fā)區(qū)［4］。但有一部分學(xué)者采用敏感的PCR法并未在食管癌組織中發(fā)現(xiàn)有HPVs感染的存在［5］。因此，HPVs在食管癌病因中的作用目前還存在爭(zhēng)議。本組研究通過(guò)雙探針原位雜交檢測(cè)食管鱗癌中高危型HPV16/18基因，并探討HPV16/18與食管組織病變的相關(guān)性，旨在明確HPV與食管鱗癌發(fā)生的相關(guān)性，及其誘導(dǎo)食管癌發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

隨機(jī)抽取江蘇省泰興市人民醫(yī)院2007年1月至2008年10月食管鱗癌根治術(shù)后標(biāo)本72例，有完整的臨床、病理資料，所有病例術(shù)前未經(jīng)放療或化療，均經(jīng)手術(shù)后病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。所有標(biāo)本重新經(jīng)兩名富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師閱片復(fù)診，病理診斷無(wú)誤。其中男性51例，女性21例；年齡38～74歲，平均（61±7）歲。腫瘤病理組織學(xué)分級(jí)：G1高分化18例，G2中分化51例，G3低分化3例；依據(jù)2009年UICC食管癌國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期9例、Ⅱ期51例、Ⅲ期11例、Ⅳ期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。另設(shè)48例對(duì)照組，其中正常鱗狀上皮組織18例，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變12例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變18例。

1．2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4μm，作HE常規(guī)染色和原位雜交檢測(cè)。HPV16/18雜交液、組織細(xì)胞原位顯示配套試劑盒（DAB法），PBS緩沖液均購(gòu)自福州泰普生物科學(xué)有限公司。操作按試劑盒步驟進(jìn)行，雜交預(yù)處理用微波高火處理30min，自然冷卻后加雜交液。拷貝過(guò)夜時(shí)間不能超過(guò)16h。試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照：已知HPV16/18陽(yáng)性的宮頸癌切片。

1．3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

HPV16/18原位雜交陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。對(duì)腫瘤細(xì)胞的觀察標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性（+）：細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)棕黃色顆粒；陰性（-）：細(xì)胞不著色。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HPV16/18在食管組織中的表達(dá)

HPVs原位雜交陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核和/或胞質(zhì)內(nèi)。食管鱗癌（圖1）中陽(yáng)性細(xì)胞多位于腫瘤組織的中央?yún)^(qū)域，層狀分布特征消失，分布不均勻，少數(shù)病例有較強(qiáng)的信號(hào)彌漫分布。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變上皮（圖2），陽(yáng)性細(xì)胞層次不明顯，多數(shù)病例占上皮全層2/3厚以上，表層細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)粗塊狀，近基底細(xì)胞信號(hào)顆粒狀。正常食管上皮黏膜陽(yáng)性信號(hào)多位于表層細(xì)胞上1/3，越近表層，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)越多，雜交點(diǎn)粗而多，甚至呈塊狀。低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變病例組12例均未見(jiàn)陽(yáng)性。

2．2 HPV16/18表達(dá)與食管鱗癌臨床分期、病理分級(jí)和臨床特征的關(guān)系及HPV16/18在食管正常上皮、瘤變和癌變組織中表達(dá)的比較

正常食管上皮HPV16/18陽(yáng)性率明顯低于食管癌，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變HPV16/18陽(yáng)性率低于食管癌，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變HPV16/18陽(yáng)性率明顯低于食管癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而HPV16/18陽(yáng)性率在正常食管上皮與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、正常食管上皮與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變上，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HPV16/18的表達(dá)與食管鱗癌的病理分期、病理分級(jí)、腫瘤大體形態(tài)、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表1～3。

表1H P V 16/18表達(dá)與食管鱗癌臨床分期、病理分級(jí)的關(guān)系T a b.1H P V 16/18e x p r e s s i o na n di t s r e l a t i o n s h i pw i t he s o p h a g e a l s q u a mo u s c a r c i n o ma c l i n i c a ls t a g i n g a n d p a t h o l o g i c g r a d i n g HPV16/18expressing Positive Negative Clinical stging 72StageⅠ 9 4（44.44%） 5StageⅡ 51 29（56.86%） 22StageⅢ 11 6（54.55%） 5StageⅣ 1 1（100%） 0Pathological grading G1 18 9（50%） 9G2 51 30（58.82%） 21G3 3 1（33.33%） 2Item n

表2H P V 16/18表達(dá)與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系T a b.2H P V 16/18e x p r e s s i o na n di t s r e l a t i o n s h i pw i t he s o p h a g e a l s q u a mo u s c a r c i n o ma c l i n i c a l f e a t u r e s HPV16/18expression Positive Negative LN metastasis 72Positive 25 14（56.00%） 11Negative 47 26（55.32%） 21Age（year）＜50 5 1（20.00%） 4≥50 67 39（58.21%） 28Sex Male 51 28（54.90%） 23Female 21 12（57.14%） 9Gross morphology Ulcerative type 27 15（55.56%） 12Medullary type 28 18（64.29%） 10Constriction type 14 6（42.86%） 8Fundus type 3 1（33.33%） 2Invasive type T1 10 5（50.00%） 5T2 38 19（50.00%） 19T3 24 16（66.67%） 8LN，lymph node.Clinical features n表3正常食管上皮、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、食管癌H P V 16/18表達(dá)的比較T a b.3T h ec o mp a r i s i o no f H P V 16/18e x p r e s s i o na mo n gn o r ma l e s o p h a g e a l e p i t h e l i u m，l o w-g r a d ei n t r a e p i t h e l i a l n e o p l a s ia，h i g h-g r a d e i n t r a e p i t h e l i a ln e o p l a s i a a n d e s o p h a g e a l c a r c i n o ma HPV16/18expression Positive Negative NEE 18 4（22.22%）1） 14LIN 12 0（0）2） 12HIN 18 3（16.67%）3） 15ECA 72 40（55.56%） 32NEE，normal esophageal epithelium；LIN，low-grade intraepithelial neoplasia；HIN，high-grade intraepithelial neoplasia；ECA，esophageal carcinoma.1）P＜0.05vs ECA；2）P＜0.01vs ECA；3）P ＜ 0.05vs ECA.Histological type n

3 討論

HPVs是小分子DNA腫瘤病毒，屬乳頭瘤病毒亞組，HPVs共有8個(gè)主要的開(kāi)放讀框即E6、E7、E1、E2、E4、E5、L1和 L2ORFs。在早期開(kāi)放讀碼框架中，E6和E7基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)刺激最為重要，E6及E7基因多整合入宿主基因組，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用，被公認(rèn)為病毒癌基因。Münger等［6］研究發(fā)現(xiàn)E6、E7編碼的E6、E7蛋白可引起子宮頸上皮細(xì)胞永生化。體外研究表明，高危型E6能與P53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)依賴泛素的蛋白酶系統(tǒng)誘導(dǎo)p53蛋白降解，使其失去抑癌作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。E7可與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤腫瘤抑制基因蛋白（Rb）的p21結(jié)合，導(dǎo)致p21cipl/WAF表達(dá)降低，是HPVs致癌的主要機(jī)制［7］。

HPVs感染食管上皮黏膜是一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，可潛伏在細(xì)胞內(nèi)若干年，一旦機(jī)體免疫力降低，潛伏的病毒可恢復(fù)活動(dòng)。其感染途徑可能與呼吸道感染相似，即胎兒宮內(nèi)感染或生產(chǎn)過(guò)程中感染，以及口－生殖器非正常接觸等。既往研究中認(rèn)為：HPVs是一種非溶性病毒，其感染與生長(zhǎng)周期依賴于基底細(xì)胞的分化。在感染初期，HPVs始終存在于上皮細(xì)胞中并保持少量復(fù)制，編碼少量非分泌性蛋白，并盡量延遲在分化上皮中的表達(dá)，在復(fù)制與裝配過(guò)程中也沒(méi)有細(xì)胞溶解和細(xì)胞病理性死亡，因而此時(shí)機(jī)體檢測(cè)不到病毒與病毒蛋白，限制了系統(tǒng)抗原的提呈，無(wú)法產(chǎn)生“危險(xiǎn)信號(hào)”警示免疫系統(tǒng)。在感染初期，HPVs僅作為游離體進(jìn)入宿主細(xì)胞，但隨著疾病進(jìn)展，在絕大部分宮頸浸潤(rùn)癌中都存在著HPVs與宿主基因組的整合［8］。這種整合可使E2開(kāi)放讀碼框架失活，由于E2是HPVs中唯一具有抑制病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄的基因，其失活使E6與E7的轉(zhuǎn)錄不受限制而能繼續(xù)大量進(jìn)行，從而使基因的微小突變可能得以逐步積累，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)10～20年多步驟發(fā)展過(guò)程誘發(fā)宮頸癌。

在HPVs感染與食管病變程度的關(guān)系研究中，師曉天等［9］采用食管脫落細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)河南省高發(fā)區(qū)食管癌患者（80%）及正常志愿者（46%）以及非癌食管上皮細(xì)胞均有HPV高危型（16、18）感染。在正常志愿者中感染率隨細(xì)胞癌前病變的加重而增高。姚品芳等［10］應(yīng)用原位雜交方法檢測(cè)82例食管癌組織中HPVs感染情況，結(jié)果在3組研究對(duì)象中均發(fā)現(xiàn)有HPVs感染，分別為30.0%、25.0%、31.8%。

本組研究中發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者HPV16/18表達(dá)陽(yáng)性率為55.56%，HPV16/18原位雜交陽(yáng)性信號(hào)位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。正常食管上皮、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變HPV16/18陽(yáng)性率均明顯低于食管鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示HPV16/18與食管的鱗狀上皮惡化有一定相關(guān)性，但與食管鱗癌的病理分期、病理分級(jí)、腫瘤大體形態(tài)、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。泰興地區(qū)食管鱗癌組織中存在HPVs感染，HPVs感染可能是其發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。HPVs感染可能與泰興地區(qū)食管鱗癌的發(fā)生存在聯(lián)系，但最終確定HPVs感染與泰興地區(qū)食管癌的關(guān)系，還需要大量檢測(cè)本地區(qū)正常人群中HPVs感染情況，并進(jìn)行追蹤隨訪。且其發(fā)病機(jī)理是否與宮頸癌相同，還有待進(jìn)一步研究。

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（編輯裘孝琦，英文編輯王又冬）

Expression of HPV16/18in Esophageal Squamous Carcinoma in Taixing Area

ZHOU Ping1，WANG Xiu-zhen2，ZHU Zheng-long1，LIU Jing1，LI Xia1
（1.Department of Pathology，Taixing People’s Hospital，Yangzhou University，Taixing 225400，China；2.Department of Pathology and Pathol-physiology，F(xiàn)oundmental Medicine and Bioscience College，Medical Branch of Suzhou University，Suzhou 215123，China）

ObjectiveTo explore the expression of human papilloma virus 16/18（HPV16/18）in esophageal squamous carcinoma.Method We applied double-exploring probe to detect HPV16/18in 72cases of esophageal squamous carcinoma，18cases of normal esophageal normal mucosa，12cases of low-grade intraepithelial neoplasia and 18cases of high-grade intraepithelial neoplasia and studied its relationship with esophageal squamous carcinoma.ResultsThe positive rate of HPV16/18in esophageal squamous carcinoma was 55.67%（40/72）.The positive rate of HPV in normal esophageal epithelium，high-grade intraepithelia neoplasia and low-grade intraepithelial neoplasia was remarkably lower than that of esophgeal carcinoma and it had statistic significance（P<0.05）.ConclusionHPV16/18had no correlation with the clinical staging，pathological grading，gross morphology，lymph node metastasis，sex，age and the invasive depth of esophageal squamous carcinoma，but had some correlation with maglignant transformation of esophageal squamous epithelium and can provide proof for preventive treatment of esophageal squamous carcinoma.

HPV16/18；double-exploring probe；in-situ hybridation；esophageal squamous carcinoma

R735.1

A

0258-4646（2011）02-0172-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.019

周萍（1978-），女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail：txapple78@sina.com.cn

2010-09-04