生物光子與藏藥七十味珍珠丸的藥理機制

孫 燕，馮 斌，龍運然，戴甲培*

(1中南民族大學武漢神經(jīng)科學和神經(jīng)工程研究所，武漢430074;2中南民族大學藥學院，武漢430074)

七十味珍珠丸(RNPS)是傳統(tǒng)藏藥大組方藥品的典型代表，其主要功能為安神、鎮(zhèn)靜、通經(jīng)活絡、調(diào)和氣血和醒腦開竅.經(jīng)過長期(數(shù)百年)的臨床實踐證明，RNPS對血壓失調(diào)和心肌梗塞、腦動脈硬化、腦血栓、腦卒中及其后遺癥(半身不遂、癱瘓)、癲癇、四肢麻木、拘攣僵直和角弓反張等心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和疾病有確切的預防作用和療效［1-5］.同時_，服用藏藥RNPS也具有滋補健身和抗衰老等功效.一些初步的實驗研究發(fā)現(xiàn):RNPS可明顯降低大鼠“血瘀”低切變率下的全血黏度和全血還原黏度，并有利于血液循環(huán)的改善，具有一定的活血化瘀作用［6］.藏藥RNPS對動物腦缺血具有保護作用，藏藥RNPS灌胃給藥對小鼠自主活動具有明顯的抑制作用，對戊巴比妥鈉閥下睡眠劑量具有明顯的協(xié)同作用，并對乙醚引起的小鼠睡眠具有顯著的協(xié)同作用，提示該藥具有明顯的中樞鎮(zhèn)靜作用［7］，同時該藥的抗驚厥作用與腦內(nèi)γ—氨基丁酸水平有關［8，9］.RNPS對乙醇所致小鼠學習記憶再現(xiàn)缺失和對樟柳堿所致小鼠記憶獲得保障均具有良好的改善作用［10，11］.

生物光子是生物超弱發(fā)光(Ultraweak bioluminescence)的簡稱，普遍存在于細菌、微生物、植物、動物和人等各種生物體［12，13］.目前的研究表明，生物光子的活動和變化與機體的生理、病理狀態(tài)有關.Inaba小組的研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥、糖尿病和黃疸等疾病患者的血液中生物光子輻射強度遠高于健康人［14，15］.而生物光子特性改變與生理、病理狀態(tài)密切相關.生物體內(nèi)的氧化代謝、脫氧化作用、機械、熱、化學應激、生物節(jié)律、情緒改變以及腫瘤發(fā)生等都有著內(nèi)在的聯(lián)系［16-20］.在人體上的研究表明，生物光子活動與意識、冥想、光幻視、睡眠和針灸經(jīng)絡有關［21-26］.

鑒于藏藥RNPS復雜的藥物成分和廣泛的生理和藥理作用，而生物光子的活動與機體生物活動有重要的聯(lián)系，因此，我們假設藏藥RNPS可能通過影響和調(diào)節(jié)機體生物光子的活動參與了其藥理機制.本研究將使用中南民族大學武漢神經(jīng)科學和神經(jīng)工程研究所最新構建的生物光子檢測(成像)系統(tǒng)來研究藏藥七十味珍珠丸對小鼠腦、肝和腎臟組織細胞生物光子活動的影響，探討其可能的藥理機制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物購自湖北省疾病預防控制中心.健康成年雌性昆明小鼠，體重30～50 g，飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由攝食和飲水，溫度18～25℃，濕度40% ～50%，飼料為普通動物飼料，在中南民族大學動物室內(nèi)適應一周后進行實驗.

1.2 主要試劑

改良的人工腦脊液(M-ACSF)(252 mM蔗糖，26 mM NaHCO3，1.8 mM KH2PO4，10 mM D-葡萄糖;pH 7.6;滲 透 壓 312 mOsmL－1);0.9% NaCl(pH 7.4);七十味珍珠丸(國字準字 Z54020062，西藏自治區(qū)藏藥廠).

1.3 主要儀器

體視顯微鏡(型號:AZ100，尼康株式會產(chǎn)，含Plan Apo0.5×、1×、5×鏡頭)、EM-CCD 及其控制器(型號:C9100-13，日本濱松光子學株式會社;EM增益的調(diào)節(jié)范圍為4～1200;當EM增益為1200時，暗電流為0.01e/p/s;在可見光范圍內(nèi)，其量子效率可以達到90%以上)、低溫冷卻液循環(huán)泵(型號:DLSB-5L/20，鞏義市子華儀器有限責任公司)、蠕動泵(型號:BT100-1J，含DG-4泵頭，保定蘭格恒流泵有限公司)、預加熱器(型號:SH-27B型，美國Warner公司)、雙控恒溫灌流控制器(型號:TC-344B型，武漢瑞普寧科技有限公司)、高亮LED燈(額定電壓3V;直流供電;白，波長范圍為410～600 nm，發(fā)光強度為10000～12000 mcd)、暗箱(外層鋼板內(nèi)層鉛板，90.5 cm ×75.5 cm ×110.5 cm，上海艾道艾機械設備有限公司)、圖像獲取和分析軟件.

1.4 生物光子檢測系統(tǒng)的構建

生物光子檢測系統(tǒng)主要由3部分組成，即檢測子系統(tǒng)、狀態(tài)維持子系統(tǒng)和刺激子系統(tǒng)，如圖1所示.

檢測子系統(tǒng):該部分直接用于采集分析數(shù)據(jù)，主要包括體視顯微鏡(用于觀察樣品)、EM-CCD及其控制器(用于拍攝樣品圖像和采集生物光子信息)、計算機(內(nèi)裝有與EM-CCD配套的SimplePCI軟件，可對EM-CCD進行設置和控制，并可對EM-CCD所采集得到的資料進行提取和分析)、低溫冷卻液循環(huán)泵(在EM-CCD水冷模式下，對EM-CCD進行制冷輔助).

狀態(tài)維持子系統(tǒng):該部分主要是為了保持檢測過程中組織(或細胞)的活性，包括灌流槽(用于放置樣品，并可通過置換其內(nèi)的灌流液，維持組織的活性)、儲液瓶(500 mL;用于儲存 M-ACSF等灌流液)、氣瓶(用于儲存混合氣體，保持灌流液體pH值和氧氣濃度穩(wěn)定，維持細胞活性)、蠕動泵(用于為灌流液進出灌流槽提供動力)、預加熱器(對進入灌流槽的液體進行預加熱，使進入灌流槽的液體維持一定的溫度)、雙控恒溫灌流控制器(用來調(diào)節(jié)和控制預加熱器和灌流槽的加熱溫度，并可實時監(jiān)測液體溫度，使組織在實驗過程中保持恒溫)、暗箱(用于隔絕外界光線和宇宙射線).

刺激子系統(tǒng):該部分主要在實驗過程中，對組織進行光、化學等刺激，包括光刺激器(以LED燈為基礎制作，通過更換不同波長的LED或加載窄帶濾光片對組織進行光照刺激，也可以用激光作為刺激光源)和光控制器(用來調(diào)節(jié)光線強度、光照時間等).

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組

健康昆明雌性小鼠隨機分成兩組:實驗組(RNSP組，n=12)和對照組(NaCl組，n=6).然后將實驗組再隨機分為低劑量0.5 g/kg和高劑量2.0 g/kg兩個亞組(各亞組n=6).

圖1 生物光子檢測(成像)系統(tǒng)Fig.1 Biophoton detection(imaging)system

1.5.2 模型制備

RNSP處理:灌胃給藥(ig)，對照組給等量生理鹽水.實驗組分別按RNSP 0.5 g/kg和2.0 g/kg給藥，每天1次，共10 d.

灌胃方法:小鼠經(jīng)口灌胃給藥模型，先用右手將小鼠尾部抓住并提起，置于籠蓋，用左手的拇指和食指抓住兩耳和頸背部皮膚，然后將小鼠置于左手心中，拉直后肢，以小指按住尾巴.將灌胃針輕壓至小鼠舌根，使口腔和食道成一條直線后，再將灌胃針沿上腭壁輕輕進入食道(一般將灌胃針插入2 cm即可).如果灌胃針插入的位置正確，小鼠會自己吞服藥液，視為灌胃成功.如灌胃針插入的位置不正確，則小鼠會引起強烈掙扎，必須撥出重插，否則可能將藥物灌入氣管，會造成小鼠立即死亡.注射完后輕輕抽出灌胃針.

1.5.3 生物光子的檢測

(1)取材和樣品預處理.全部實驗動物分別存活到預定時間點第11 d時(即ig給藥第10 d后)，將動物稱重后在10%水合氯醛深度麻醉下，斷頭處死，立刻將頭浸泡于冰水浴的M-ACSF中(約10 s)，然后小心地將全腦取出.再用刀片冠狀切面切取腦片(300μm)，將分離的腦片放入提前1 h通入95%O2和5%CO2混合氣的冰水浴M-ACSF中暫存并持續(xù)充氧.同時分離肝和腎，并將肝組織切成厚片(300μm)，將分離的肝組織片和腎放入氣體飽和的M-ACSF中充氧(圖2).

(2)生物光子成像參數(shù)的選定.依據(jù)本實驗室所構建的生物光子檢測(成像)系統(tǒng)，將增益水平設置為1200后進行成像;每張圖像曝光時間設置為6 s;對樣品進行20 min的實時生物光子成像記錄;白光LED光照時間為1 min.

圖2 不同組織的圖片F(xiàn)ig.2 Pictures of different tissues

(3)生物光子成像實驗步驟.將組織樣本放置灌流槽中(以下所有實驗均在室溫25℃左右條件下進行)，用少量M-ACSF濕潤樣本，先拍攝定位圖像，關閉暗箱，避光約40 min，以排除環(huán)境光所引起的誘發(fā)光的干擾(其在15 min內(nèi)基本衰減為本底的自發(fā)光);繼續(xù)對樣品進行20 min的實時生物光子成像;白光LED對樣品施加1 min光照射后實時成像20 min.

(4)圖像處理和數(shù)據(jù)提取.用EM-CCD配備的圖像處理分析軟件(SimplePCI 6.0)對圖像和數(shù)據(jù)進行處理.

(5)統(tǒng)計學分析.所有數(shù)據(jù)結果使用SPSS13.0分析，采用雙尾Student-t檢驗，各組之間差異用配對t檢驗分析，所有數(shù)據(jù)均以ˉx±std表示，顯著性標記如下:*P＜0.05(顯著性差異)，＊＊P＜0.01(非常顯著性差異).

2 結果

2.1 RNSP處理后腦片、肝和腎組織樣本生物光子輻射和光誘導后生物光子輻射的改變

在避光暗適應40 min后成像20 min(0～1200 s，見圖3 A，D 和 G，或者見圖3 B，E 和 H)，實驗組和對照組樣品均具有穩(wěn)定的生物光子輻射的本底值(基值)，灰度值均在2208左右，且不同樣品(腦、肝和腎)沒有明顯差異.在白光照射1 min后，腦、肝和腎組織樣本都表現(xiàn)明顯的增強生物光子輻射和類似的衰減趨勢(1200 ～2400 s，見圖3 A，D和G)，但腦組織衰減曲線在實驗組和對照組有明顯不同，實驗組比對照組衰減要慢(圖3 C)，而肝和腎組織表現(xiàn)不明顯(圖3 F，I).

實驗組和對照組樣品(腦、肝和腎)均具有穩(wěn)定的生物光子輻射的本底值(基值，0～1200 s，見圖3 A，D和G，或者見圖3 B，E和H)，且不同樣品(腦、肝和腎)沒有明顯差異.同時，1 min光刺激后(1200 s時間點)表現(xiàn)明顯的誘發(fā)生物光子輻射，而且腦組織衰減曲線在實驗組和對照組有明顯不同(圖3 C)，但肝和腎組織表現(xiàn)不明顯(圖3 F，I).圖3B，E和H分別是A，D和G在0～1200 s區(qū)間成像的放大圖.

圖3 不同組織的生物光子輻射和衰減圖Fig.3 Diagram of the biophoton emission and decay in different tissues

2.2 比較白光照射對誘發(fā)生物光子輻射和衰減過程的影響

我們比較了在白光照射1 min后，實驗組與對照組的不同組織(腦、肝和腎)誘發(fā)生物光子輻射的最大值的變化情況.總的來看，不管是實驗組還是對照組誘發(fā)生物光子輻射的最大值灰度值改變?yōu)?腦＞腎＞肝.盡管統(tǒng)計學檢驗沒有發(fā)現(xiàn)差異，但高、低劑量RNSP處理后腦組織誘發(fā)生物光子輻射的最大值灰度值比對照組高(圖4 A).此外，比較實驗組與對照組的不同組織(腦、肝和腎)誘發(fā)生物光子輻射衰減到50%時灰度值(圖4 B)和衰減到50%時所需要的時間(圖4 C).

不同組織(腦、肝和腎)實驗組與對照組最大值無明顯差別，而組織間實驗組與對照組最大值灰度值差別明顯，腦＞腎＞肝，特別是腦片與肝臟差異極其顯著(圖4 A，B).同時，比較實驗組與對照組的不同組織(腦、肝和腎)誘發(fā)生物光子輻射衰減到50%時所需要的時間(圖4 C).＊＊表示統(tǒng)計學差異極其顯著(P＜0.01).

圖4 白光照射對不同組織的誘發(fā)生物光子輻射的影響Fig.4 Effect ofwhite light illumination on the induced photon emission in different tissues

3 討論

長期的臨床應用發(fā)現(xiàn)藏藥七十味珍珠丸具有控制高血壓、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用，對心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病有確定和較好的療效，但其確切的藥理作用機制仍不明確.藏藥七十味珍珠丸的藏文譯音為然那桑培(Rannasangpei，簡稱RNSP)，RNSP是傳統(tǒng)藏藥大組方藥品的典型代表之一，它是由70余種名貴藏藥原料組成.RNSP一個明顯的特點是該藥的組成成分含有一定量的金、銀、銅和鐵等10余種重金屬礦物質(zhì)，盡管有些傳統(tǒng)的中藥方劑也應用了一些含有重金屬成分藥物，但RNSP所包含的這些成分顯得尤為特別.雖然在藏藥七十味珍珠丸的制藥過程中經(jīng)過一系列獨特的炮制技術后可能降低了藥品的毒性和提高了臨床用藥的安全性，但這些重金屬成分的存在與RNSP藥效可能有一定的關系，而且，傳統(tǒng)的藏藥七十味珍珠丸的炮制需要一定的時間并帶有神秘的宗教色彩.

生物光子是普遍存在于自然生物界的一種極其微弱的光子輻射現(xiàn)象，小至細菌微生物，大到植物、動物甚至人，都有自發(fā)的生物光子發(fā)射.對動物和人的研究發(fā)現(xiàn)生物光子的活動與生物體生理狀態(tài)和病理過程有著密切的聯(lián)系，自然環(huán)境的光作用于生物體的細胞和分子可以引起生物體生物光子的活動，進一步對生物體的功能活動(如代謝、信息傳遞等)產(chǎn)生影響.研究發(fā)現(xiàn)血液細胞可以起到傳遞生物光子能量和信息的作用，即一個組織的生物光子活動可以通過血液將其生物光子能量和信息傳到其它的組織和細胞［20］.我們最近的研究發(fā)現(xiàn)生物光子可能起到神經(jīng)信號傳遞的作用，并可能對于一些特殊視覺現(xiàn)象如光幻視、視覺后像以及視網(wǎng)膜離散暗噪音產(chǎn)生的機制提供新的解釋［27-29］.此外，生物體生物光子的異常改變可能與老年、疾病的過程如腫瘤的發(fā)生等也有一定的聯(lián)系［30-32］.因為生物光子的活動不完全停留在細胞和分子水平，已經(jīng)涉及到了分子的原子水平，甚至需要用量子的理論才能給予解釋.是否傳統(tǒng)醫(yī)藥的藥理機制已經(jīng)涉及到了原子水平和量子的理論值得我們探討.

在本研究中，我們假設RNPS可能通過影響機體的生物光子的活動來發(fā)揮藥理作用.通過建立實驗小鼠模型并應用先進的生物光子成像系統(tǒng)進行測定，結果發(fā)現(xiàn)腦片、肝和腎均具有自發(fā)生物光子輻射現(xiàn)象和明顯增強的光誘發(fā)生物光子輻射.RNPS處理雖然沒有改變腦、肝和腎組織樣本的自發(fā)生物光子輻射，但增強了腦、肝和腎組織樣本的光誘發(fā)生物光子輻射強度.特別是對腦組織光誘發(fā)生物光子輻射衰減過程產(chǎn)生影響.我們的結果提示RNPS處理可能影響了動物組織和器官生物光子的活動，發(fā)揮其藥理作用，但是確切的機制有待進一步研究，我們推測可能的作用機制是:(1)藏藥七十味珍珠丸對胃腸道組織的直接作用，影響其生物光子的活動，活動信息可能通過血液的能量(生物光子光能)轉換，進一步影響或調(diào)節(jié)其它組織器官的功能.(2)藏藥七十味珍珠丸的藥效成分通過胃腸道組織的直接吸收，通過血液循環(huán)到達組織器官，直接影響或調(diào)節(jié)組織器官和細胞的功能.

上面提到藏藥七十味珍珠丸一個明顯的特點是該藥的組成成分含有一定量的金、銀、銅和鐵等10余種重金屬礦物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)一些重金屬礦物質(zhì)有高效率轉換光能(吸收和輻射)的特征，這是否與藏藥七十味珍珠丸增強生物光子輻射強度有直接的關系有待進一步研究.

4 結語

我們發(fā)現(xiàn)藏藥七十味珍珠丸處理昆明小鼠能影響腦、肝和腎組織光誘發(fā)生物光子輻射的強度和衰減過程，可能是藏藥七十味珍珠丸發(fā)揮其廣泛臨床治療作用的原因之一，其作用機制可能是通過影響或調(diào)節(jié)組織器官和細胞生物光子活動以及生物信號傳遞，確切的機制有待進一步研究.

［1］路志強，岳志麗.藏藥七十味珍珠丸的臨床應用及研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2000，6(增刊):91-92.

［2］陳秋紅，海平.七十味珍珠丸研究概況［J］.遼寧中醫(yī)學院學報，2001，3(4):306-307.

［3］秦 蘭，張翠松.牽正散合七十味珍珠丸治療面癱［J］.中國中醫(yī)急癥，2001，3:317.

［4］恩和，阿木，陶格蘇.七十味珍珠丸治療風濕性關節(jié)炎108例［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2001，7(2):13.

［5］更等，尖措吉.藏藥七十味珍珠丸治療植物神經(jīng)功能紊亂［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，1999，5(4):19.

［6］陳秋紅.七十味珍珠丸對兔球結膜及軟腦膜微循環(huán)的影響［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2001，18(3):187-189.

［7］文青杰，艾措千，海平，等.藏藥七十味珍珠丸的鎮(zhèn)靜作用研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，1998，4(2):41-42.

［8］海平，周生祥，文青杰，等.藏藥七十味珍珠丸抗驚厥作用研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，1998，4(2):45-46.

［9］海平.藏藥七十味珍珠丸對驚厥小鼠腦內(nèi)氨基酸含量的影響［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2003，20(1):3-5.

［10］王曉勤，海平，周生祥，等.藏藥七十味珍珠丸對小鼠學習記憶再現(xiàn)缺失的作用［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2001，7(2):30-31.

［11］王曉勤，海平.藏藥七十味珍珠丸對樟柳堿所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用［J］.青海醫(yī)學院雜志，2001，31(7):1-2.

［12］Devaraj B，Usa Inaba MH.Biophotons:ultraweak light emission from living systems［J］.Current Opinion in Solid State and Materials Science，1997，2，188-193.

［13］Tilbury RN，Cluickenden TI.Spectral and time dependence studies of the ultraweak bioluminescence emitted by the bacterium Escherichia coli［J］.Photochem.Photobiol，1998，47，145-150.

［14］Swinbanks D.Japan:body light points to health［J］.Nature，1986，324(6094):203.

［15］Takeda M，KobayashiM，Takayama M，et al.Biophoton detection as a novel technique for cancer imaging［J］.Cancer Science，2004，95(8):656-661.

［16］Golantsev VP，Koralenko SG，Moltchanov AA，et al.Lipid peroxidation，low-level chemiluminescence and regulation of secretion in the mammary gland［J］.Experientia，1993，49(10):870-875.

［17］Kataoka Y，Cui Y，Yamagata A，et al.Activity dependent neural tissue oxidation emits intrinsic ultraweak photons［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2001，285(4):1007-1011.

［18］KobayashiM，Takeda M，Ito KI，et al.In vivo imaging of spontaneous ultraweak photon emission from a rat＇s brain correlated with cerebral energy metabolism and oxidative stress［J］.Neuroscienc Res，1999，34(2):103-113.

［19］KobayashiM，Takeda M，Ito KI，et al.Two dimensional photon counting imaging and spatiotemporal characterization of ultraweak photon emission from a rat＇s brain in vivo［J］.JNeurosci Methods，1999，93(2):163-168.

［20］Fels D.Cellular communication through light［J］.PLoS One，2009，4(4)，e5086.

［21］Wijk RV，Wijk EP.An introduction to human biophoton emission［J］. Forsch Komplementarmed Klass Naturheilkd，2005，12(2):77-83.

［22］Dobrin R，Kirsch C，Kirsch S，et al.Experimental measurements of the human energy field［C］//Krippner S.Psychoenergetic Systems: The Interface of Consciousness，Energy and Matter.Singapore:Gordon and Breach，1979:227-230.

［23］Kim TJ.Biophoton emission from fingernails and fingerprints of living human subjects［J］. Acupunct Electrother Res，2002，27(2):85-94.

［24］Grass F，Klimab H，Kasper S.Biophotons，microtubules and CNS，is our brain a "Holographic computer"［J］.Medical Hypotheses，2004，62(2):169-172.

［25］Bókkon I.Phosphene phenomenon:a new concept［J］.Biosystems，2008，92(2):168-174.

［26］Allen RC.Biochem［J］.Bio Phy Res Commun，1976，69:245.

［27］Sun Y，Wang C，Dai J.Biophotons as neural communication signals demonstrated by in situ biophoton autography［J］.Photochem Photobiol Sci，2010，9:315-322.

［28］Wang C，Dai J，Bokon I，et al.Spontaneous and visible light-induced ultraweak photon emission from rat eyes［J］.Brain Res，2011，1369:1-9.

［29］Bókkon I，Vimal RLP，Wang C，et al.Visible light induced ocular delayed bioluminescence as a possible origin of negative afterimage［J］. Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology，2011，103:192-199.

［30］Takeda M，KobayashiM，Takayama M，et al.Biophoton detection as a novel technique for cancer imaging［J］.Cancer Science，2004，95(8):656-661.

［31］Maccarrone M，Rosato N，F(xiàn)inazzi A.Lipoxygenase products induce ultraweak light emission from human erythroleukemia cells［J］.Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence，1997，12(6):285-293.

［32］Kim J，Lim J，Kim H，et al.Scanning spontaneous photon emission from transplanted ovarian tumor ofmice using a photomultiplier tube［J］.Electromagnetic Biology and Medicine，2006，25(2):97-102.