應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤中MMP-2，MMP-9的表達(dá)及與臨床病理行為的關(guān)系

趙瀅，張?zhí)毂耄鯊?qiáng)

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院胃腸營養(yǎng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤中MMP-2，MMP-9的表達(dá)及與臨床病理行為的關(guān)系

趙瀅1，張?zhí)毂?，王強(qiáng)1

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院胃腸營養(yǎng)外科，沈陽 110004；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

目的檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在GIST中的表達(dá)及其與臨床病理行為的關(guān)系。方法 收集124例GIST標(biāo)本，用組織芯片和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MMP-2，MMP-9表達(dá)。結(jié)果 在124例GIST中，MMP-2陽性表達(dá)81例（65.3%）；MMP-9陽性表達(dá)74例（59.7%）；其表達(dá)與GIST侵襲轉(zhuǎn)移、NIH分級(jí)、黏膜受侵有相關(guān)性，二者之間呈正相關(guān)（r=0.716，P＜0.05）。結(jié)論MMP-2，MMP-9在GIST組織中高表達(dá)，這為揭示GIST的發(fā)生發(fā)展提供了新的理論依據(jù)。

胃腸道間質(zhì)瘤；組織芯片；免疫組化；MMP-2；MMP-9

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多種成分參與的連續(xù)過程，在此過程中，腫瘤組織對(duì)基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細(xì)胞能否形成轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，目前研究認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)（matrix metallo proteinse，MMPs）是參與此過程的最重要的酶系統(tǒng)［1］。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）與 GIST 浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［2］。本研究通過構(gòu)建GIST組織芯片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，探討兩者相關(guān)性，及其與GIST臨床病理行為的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇臨床病理資料完整的中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院1993年9月～2010年2月手術(shù)切除、病理證實(shí)的GIST新鮮組織標(biāo)本124例。男性64例、女性60例，年齡9～79歲、平均54.6歲。腫瘤發(fā)生于胃62例（50.0%）、小腸28例（22.6%）、結(jié)直腸14例（11.3%）、食管 9例（7.3%）、胃腸道外 11例（8.9%）（其中網(wǎng)膜4例、腸系膜4例、后腹膜3例）。

GIST的診斷標(biāo)準(zhǔn)：常規(guī)形態(tài)符合GIST診斷要點(diǎn)。依據(jù)Fletcher等［3］提出的GIST生物學(xué)行為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)（NIH分級(jí)）。另取腫瘤旁組織作為對(duì)照。

1.2 組織芯片的制備

組織芯片的制作利用陜西超英生物公司病理研究院醫(yī)學(xué)研發(fā)中心的組織陣列儀，制成“胃腸道間質(zhì)瘤多組織腫瘤芯片”，請(qǐng)病理科醫(yī)生進(jìn)行光鏡觀察，確保所選的標(biāo)本符合要求。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)請(qǐng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院的病理學(xué)科有資質(zhì)醫(yī)生3名分別協(xié)助進(jìn)行閱片，閱片者對(duì)組織切片的背景信息不了解，以其中結(jié)果相同的2位醫(yī)生的評(píng)分為某組織點(diǎn)的得分。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

兔抗人Claudin-4多克隆抗體（1∶400稀釋，Thermo Scientific）；二抗（羊抗兔試劑盒，S-P 法，Labvision）。操作步驟按常規(guī)操作進(jìn)行，以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

（1）陽性細(xì)胞數(shù)量計(jì)0～4分：無計(jì)0分，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì) 4分；（2）染色強(qiáng)度計(jì) 0～3分：無色計(jì) 0分，淺黃色計(jì) 1分，棕黃色計(jì) 2分，棕褐色計(jì) 3分；（1）+（2）>3分計(jì)為陽性，≤3分計(jì)為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率法分析組間差異和相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片構(gòu)建情況

所有點(diǎn)陣排列整齊，HE染色基本無掉片、重疊和扭曲現(xiàn)象，免疫組化染色中無點(diǎn)脫落。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 MMP-2，MMP-9染色結(jié)果：MMP-2，MMP-9主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽性結(jié)果為胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，正常對(duì)照無陽性表達(dá)（圖1，圖2）。2.2.2 MMP-2，MMP-9表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系（表 1）

2.2.3 MMP-2，MMP-9表達(dá)水平的相關(guān)性：統(tǒng)計(jì)分析表明在GIST中MMP-2和MMP-9二者的表達(dá)存在正相關(guān)（r=0.716，P<0.05）。

表1G I S T中MMP-2，MMP-9的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系T a b.1T h ee x p r e s s i o na n dc o r r e l a t i o nt oc l i n i c a l p a t h o l o g i cf e at u r e s o f MMP-2，MMP-9i n G I S T Item n MMP-2 MMP-9Sex Male 64 41（64.06） 38（59.38）Female 60 40（66.67） 36（60.00）Age（year）≥55 70 45（64.29） 43（61.43）＜55 54 36（66.67） 31（57.41）Histological type Epithelial cell 28 19（67.86） 18（64.29）Usiform cell 73 48（65.75） 43（58.90）Mixed type 23 14（60.87） 13（56.52）Invasion and metastasis No 84 44（52.38）1） 41（48.81）2）Yes 40 37（92.50） 33（82.50）NIHⅠ63（50.00）3） 4（66.67）2）Ⅱ20 11（55.00） 10（50.00）Ⅲ37 23（62.16） 23（62.16）Ⅳ61 44（72.13） 37（60.66）Mucosal invasion No 79 44（55.70）1） 42（53.16）4）Yes 34 30（88.24） 28（82.35）1），2），P<0.05；3），4），P<0.01.

3 討論

GIST的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟的過程，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解及基底膜的破壞是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的先決條件［4］。腫瘤細(xì)胞必須具備降解ECM及基底膜的能力，而這一降解過程依靠蛋白水解酶，主要有絲氨酸蛋白酶類，半胱氨酸蛋白酶類和基質(zhì)金屬蛋白酶類［5］（matrix metallo proteinase，MMPs）。MMP-2，MMP-9是 MMPs中2個(gè)重要的酶，是能夠降解Ⅳ型膠原的主要基質(zhì)水解酶，它們一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，使瘤細(xì)胞可沿著缺失的基底膜相周圍組織浸潤，促進(jìn)腫瘤侵襲和和轉(zhuǎn)移；另一方面可通過毛細(xì)血管內(nèi)生、腫瘤新生血管生成等促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散［6，7］。

本研究結(jié)果顯示，MMP-2，MMP-9在GIST中均存在高表達(dá)，而且隨著NIH分級(jí)升高，MMP-2，MMP-9表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，提示MMP-2，MMP-9的過度表達(dá)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，水解血管基底膜，使血管通透性增高，導(dǎo)致腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)MMP-2，MMP-9表達(dá)與患者的年齡、性別及組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性，而與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及NIH分級(jí)相關(guān)（表1）。說明MMP-2，MMP-9有促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果還顯示，在GIST中MMP-2，MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.716，P=0.042），提示2者在GIST的發(fā)生發(fā)展過程中的作用密切相關(guān)，可能有協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)中研究的MMP-2、MMP-9之間可以通過PI3K/Ak信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互調(diào)節(jié)、共同參與GIST的發(fā)生發(fā)展。因此，我們認(rèn)為MMP-2、MMP-9表達(dá)可能是GIST發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，抑制其表達(dá)，阻斷腫瘤的營養(yǎng)來源和轉(zhuǎn)移通道，可望達(dá)到治療腫瘤的目的。

［1］Qie S，Sun BC，Zhao XL，et al.Correlation between expressions of matrix metalloproteinase-2&9and vasculogenic mimicry in gastrointestinal stromal tumors［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2009，89（16）：1106-1109.

［2］Fisher JF，Mobashery S.Mechanism-based profiling of MMPs［J］.Methods Mol Biol，2010，622：471－487.

［3］Fletcher CD，Berman JJ，Corless C，et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors：a consensus approach［J］.Int J Surg Pathol，2002，33（5）：81－89.

［4］Barkan D，Green JE，Chambers AF.Extracellular matrix：a gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth ［J］.Eur J Cancer，2010，46（7）：1181－1188.

［5］Naduk-Kik J，Hrabec E.The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of diabetes mellitus and progression of diabetes retinopathy［J］.Postepy Hig Med Dosw，2008，62：442－450.

［6］Lamar JM，Pumiglia KM，DiPersio CM.An immortalization-dependent switch in integrin function up-regulates MMP-9to enhance tumor cell invasion［J］.Cancer Res，2008，68（18）：7371－7319.

［7］Am觍linei C，C觍runtu ID，Giusc觍SE，et al.Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions［J］.Rom J Morphol Embryol，2010，51（2）：215－228.

（編輯孫憲民，英文編輯劉寶林）

Expression and It’s Significance of MMP-2，MMP-9in Gastrointestinal Stromal Tumor by Tissue Micro-array

ZHAO Ying1，ZHANG Tian-biao2，WANG Qiang1
（1.Gastro-intestinal Surgery and Nutrition Support Division，Department of Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Biochemistry and Molecullar Biology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the expression and it’s significance of MMP-2，MMP-9in human GIST.Methods124GIST specimens and their normal counterparts were used to detect protein expression of MMP-2，MMP-9.Result The positive expression of MMP-2was seen in 81cases of 124cases of GIST （65.3%）；the positive expression of MMP-9was seen in 74cases of 124cases of human GIST（59.7%）.The expression was closely related to NIH classification，mucosal invasion and metastasis.The positive correlation was observed in the 3genes.ConclusionThe expression of MMP-2，MMP-9was up-regulated in GIST and they might play an important role in the genesis and development of GIST.

gastrointestinal stromal tumor；tissue micro-array；immunohistochemistry；MMP-2；MMP-9

R735.2

A

0258-4646（2011）05-0444-03

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1814.011

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1814.011.html

遼寧省教育廳高校科研計(jì)劃（2009A726）

趙瀅（1978-），女，講師，碩士研究生.

王強(qiáng)，E-mail：wangq@sj-hospital.org

2011-03-01

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2011-05-1815：25