草麻黃補體抑制成分在大鼠急性脊髓損傷中的作用

李良滿，李靜波，朱悅

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1.骨科；2.感染科，沈陽 110001）

草麻黃補體抑制成分在大鼠急性脊髓損傷中的作用

李良滿1，李靜波2，朱悅1

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1.骨科；2.感染科，沈陽 110001）

目的探討草麻黃補體抑制成分在大鼠急性脊髓損傷中的作用。方法 應用多步沉淀和薄層層析方法進行草麻黃補體抑制成分的提純并進行活性鑒定；參照改良的Allen’s重物打擊法制備大鼠脊髓損傷模型；應用CH50法測定血清總補體溶血活性；應用實時PCR技術檢測細胞間黏附分子1（ICAM-1）mRNA的表達；采用運動誘發(fā)電檢測評定脊髓損傷后的神經功能。結果 在傷后12h、1d、3d、7d、14d各個時間點，實驗組CH50比值和ICAM-1mRNA表達均低于對照組（P<0.01）。傷后7d和14d，實驗組脊髓運動誘發(fā)電位潛伏期和波幅顯著優(yōu)于對照組（P<0.01）。結論草麻黃補體抑制成分能夠顯著減輕脊髓損傷后的免疫炎性反應，在繼發(fā)性脊髓損傷中起到重要的保護作用。

草麻黃；脊髓損傷；炎癥；誘發(fā)電位

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1816.029

脊髓損傷繼發(fā)性損傷機制復雜，目前臨床上還缺乏有效的治療藥物，免疫炎性反應是重要損傷機制之一，脊髓損傷后存在補體系統(tǒng)的激活，并且補體系統(tǒng)激活后產生的活性片斷及最終產物均可引起和加重損傷組織的免疫炎性反應，通過抑制補體系統(tǒng)激活而減輕免疫炎性反應有望成為脊髓損傷新的治療策略［1，2］。本研究探討中藥草麻黃（Ephedra sinica，ES）提純的補體抑制成分對大鼠急性脊髓損傷后免疫炎性反應及神經功能的影響，為急性脊髓損傷的抗補體治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 草麻黃補體抑制劑的提純

應用多步沉淀及薄層層析方法進行草麻黃補體抑制成分的提純并進行活性鑒定。1kg草麻黃加入pH4.0的蒸餾水10L，煮沸1h，過濾除渣，加入1mol/L NaOH調整pH值至9.0，室溫攪拌孵育1h，離心，洗滌沉淀3次，室溫烘干得到棕褐色粗品共18.5g。取3g粗品溶于pH4.0的蒸餾水50mL中，煮沸1h，離心棄上清，溶于pH 9.0的蒸餾水中，調整pH值至4.0，進行薄層層析，分離提取抗補體成分。

1.2 實驗動物分組及脊髓損傷模型制備

健康SD大鼠50只，SPF級，雌雄不拘，體質量250～300g。采用改良的 Allen’s重物打擊法［3］方法制備大鼠脊髓急性損傷模型，損傷部位為T10節(jié)段。隨機分為2組，每組25只。實驗組：分脊髓損傷后12h、1d、3d、7d、14d 五個時間點，每個時間點 5只，傷后1h給予提純的補體抑制成分（15mg/kg）溶于5mL生理鹽水，強制灌胃，每日1次。對照組：時間點及動物數量同前，以同樣方法給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 血清總補體溶血活性測定

應用CH50法進行血清總補體溶血活性測定。在大鼠脊髓損傷前1h、傷后12h及傷后1～14d，尾靜脈抽血0.3mL，離心，取上清，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?%綿羊紅細胞懸液，溶血素效價測定，制備50%溶血標準管，然后將各濃度梯度反應體系置于微量板孔中，反應完畢后在541nm波長處測吸光度，計算待測血清的CH50值并與損傷前血清樣品的基礎值比較，計算百分比值。

1.4 細胞間黏附分子1（intercellular adhesive molecule-1，ICAM-1）mRNA 的檢測

應用實時PCR方法檢測損傷組織中ICAM-1mRNA的表達。2組動物于傷后每個時間點各取5只再次麻醉，以傷處T10為中心取約100mg脊髓損傷組織，應用Trizol法提取總RNA，并進行RNA純度及濃度檢測，逆轉錄cDNA合成，應用Premier 5.0設計引物序列。以管家基因GAPDH作為內參。操作嚴格按照說明書進行。ICAM-1正義引物：5′-TGCC TACCCTCCCACAACAG-3′，反義引物 5′-ATACTATG TGGACGAGCATGT-3′，320bp；GAPDH 正義引物：5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，反義引物5′-AGACTCCACGACATACTCAGC-3′，283bp。應用LightCyclerⅡPCR檢測儀進行檢測，繪制融解曲線，PCR專用分析軟件根據標準品的Ct值制作標準曲線，計算每個樣本原始拷貝數，然后計算樣品基因校正后的相對含量。

1.5 運動誘發(fā)電位檢測

參照Lee［4］的方法檢測脊髓運動誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP），各組大鼠分別于脊髓損傷前 0.5h 及傷后 12h、1d、3d、7d、14d 行 MEP 檢測，檢測在銅網屏蔽下進行。大鼠麻醉后，將刺激電極陰極刺于T5～6間隙、陽極刺于T7～8間隙，刺激類型為方波脈沖電流，波寬0.1ms，強度100～150mV，濾波帶通過2Hz～10kHz。電位記錄儀采集信號并貯存，專用軟件分析和測量其潛伏期（latency，LT）和波幅（amplitude，AM）。將損傷前MEP的測量值作為基礎值，以百分比表示損傷前后的電位變化。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 血清CH50測定結果

實驗組和對照組傷后早期血清CH50比值迅速下降，約在傷后1d達到最低值，分別29.05%±2.08%和24.08%±2.31%；傷后3～7d快速上升，以后緩慢回升，傷后14d對照組CH50接近傷前水平（98.21%±1.12%），而實驗組僅達到傷前的75%左右。傷后12h及傷后1～14d各個時間點實驗組的CH50比值均低于對照組，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。

2.2 ICAM-1mRNA檢測結果

脊髓損傷后，實驗組及對照組ICAM-1mRNA相對含量開始升高，約在傷后3d達到高峰，之后開始逐漸下降，存在一個動態(tài)變化過程。傷后各個時間點實驗組ICAM-1mRNA相對含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.3 MEP檢測結果

實驗組及對照組在傷后早期AM值快速下降，僅達傷前正常值的15%左右，而且LT值明顯延長，較傷前正常值延長約30%。隨著時間的延長，AM值開始快速回升，LT值亦逐漸縮短。傷后14d，對照組AM值回升到傷前正常值的73%，實驗組AM值回升到了80%，2組的LT值亦逐漸縮短。傷后12h～3d，2組的電生理檢測指標無明顯差別；傷后7d和14d，實驗組電生理檢測指標顯著優(yōu)于對照組（P<0.01）。見圖 2。

3 討論

脊髓損傷作為一種嚴重的創(chuàng)傷，可以激發(fā)機體引起損傷組織強烈的免疫炎性反應。從嚴格意義上來講，脊髓損傷后免疫炎性反應是一把雙刃劍。一方面該過程可以清除壞死組織，促進組織細胞增生和創(chuàng)面修復。另一方面，嚴重的創(chuàng)傷時存在炎性反應的過度激活，這將導致脊髓組織進一步的損傷，妨礙脊髓組織的修復和神經元的再生，導致神經元、神經膠質細胞等繼發(fā)性的壞死和凋亡，從而阻礙損傷后神經功能的恢復［5］。

脊髓損傷后免疫炎性細胞的聚集受多種蛋白質的調控，ICAM-1又名CD54，是淋巴細胞功能相關抗原l的細胞表面配基。ICAM-1可促進中性粒細胞對組織的浸潤而增強免疫應答，促進中性粒細胞和內皮細胞相互作用，這些因素共同導致中性粒細胞浸潤和活化。本研究應用實時PCR技術檢測了脊髓損傷后脊髓組織ICAM-1mRNA的表達，結果表明，實驗組在各個時間點ICAM-1mRNA相對含量均低于對照組，提示該補體抑制劑對脊髓損傷組織中ICAM-1mRNA表達具有的顯著抑制作用，證明了其對免疫炎性反應的抑制作用。

近幾年來，通過抑制補體激活機制抑制脊髓損傷后的免疫炎性反應已經成為脊髓損傷實驗性治療的一個重要策略和熱點方向。Reynolds等［6］發(fā)現痘病毒補體調控蛋白能夠顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補體表達，減輕脊髓損傷。Qiao等［7］的研究表明，補體經典途徑與旁路途徑在脊髓損傷中起到重要作用，抑制補體激活可減輕損傷組織炎性反應，保護脊髓功能。Tei等［8］研究發(fā)現，補體C1酯酶抑制劑能夠顯著抑制補體系統(tǒng)激活，保護神經功能。作者在前期的研究中亦發(fā)現，重組可溶性補體受體I型可顯著抑制大鼠脊髓損傷后的補體激活，抑制免疫炎性反應，對神經功能發(fā)揮顯著的保護作用［9］。

本研究采用MEP評價脊髓損傷損傷后的運動功能，使研究結果更加客觀可靠。結果表明，實驗組在傷后7d和14d電生理檢測指標顯著優(yōu)于對照組，提示該補體抑制成分通過抑制脊髓損傷后的免疫炎性反應對神經功能發(fā)揮顯著的保護作用。該研究為急性脊髓損傷的抗補體治療提供了理論依據。

［1］Batchelor PE，Tan S，Wills TE，et al.Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury［J］.J Neurotrauma，2008，25（10）：1217-1225.

［2］Guo Q，Li S，Liang Y，et al.Effects of C3deficiency on inflammation and regeneration following spinal cord injury in mice ［J］.Neurosci Lett，2010，485（1）：32-36.

［3］Nessler JA，Deleon rd，Sharp K，et a1.Robotic gait analysis of bipedal treadmill stepping by spinal contused rats characterization of intrinsic recovery and comparison with BBB［J］.J Neurotrauma，2006，23（6）：882-896.

［4］Lee BH，Lee KH，Kim UJ，et al.Injury in the spinal cord may produce cell death in the brain［J］.Brain Res，2004，1020（1-2）：37-44.

［5］Chan CC.Inflammation：beneficial or detrimental after spinal cord injury?［J］.Recent Pat CNS Drug Discov，2008，3（1）：189-199.

［6］Reynolds DN，Smith SA，Zhang YP，et al.Vaccinia virus complement control protein reduces inflammation and improves spinal cord integrity following spinal cord injury ［J］.Ann NY Acad Sci，2004，1035（1）：165-178.

［7］Qiao F，Atkinson C，Kindy MS，et al.The alternative and terminal pathways of complement mediate post-traumatic spinal cord inflammation and injury［J］.Am J Pathol，2010，177（6）：3061-3070.

［8］Tei R，Kaido T，Nakase H，et al.Protective effect of C1esterase inhibitor on acute traumatic spinal cord injury in the rat［J］.Neurol Res，2008，30（7）：712-717.

［9］Li LM，Li JB，Zhu Y，et al.Soluble complement receptor type 1inhibits complement system activation and improves motor function in acute spinal cord injury［J］.Spinal Cord，2010，48（2）：105-111.

（編輯陳 姜，英文編輯劉寶林）

Effect of Inhibiting Component of Complement in Ephedra Sinica on Acute Spinal Cord Injury in Rats

LI Liang-man1，LI Jing-bo2，ZHU Yue1
（1.Department of Orthopedics；2.Department of Infectious Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of complement inhibiting component of Ephedra sinica on acute spinal cord injury in rats.MethodsThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica was isolated and purified by multiple precipitative steps and thin layer chromatography，the activity was evaluated.Induction of spinal cord injury was performed following a modified Allen’s weight-drop method.CH50method was used for Measurement of complement hemolytic activity.ICAM-1mRNA level was evaluated by real time PCR technique.ResultsCH50and ICAM-1mRNA levels were significantly reduced in the Ephedra sinica group compared with the Control group at 12h，1，3，7，14d after spinal cord injury.On the 7th and 14th day，the levels of latency and amplitude in Ephedra sinica group were significantly better than those of Control group （P<0.01）.ConclusionThe inhibiting component of complement in Ephedra sinica significantly reduced immunological inflammation after spinal cord injury，and played an important protective function in secondary spinal cord injury.

Ephedra sinica；Spinal cord injury；Inflammation；Evoked potential

R338

A

0258-4646（2011）05-0405-03

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.029.html

遼寧省科學技術計劃項目（2010225034）

李良滿（1971-），男，副教授，博士.

朱悅，E-mail：yuezhudr@163.com

2011-01-17

網絡出版時間：2011-05-1815：25