液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分離鑒定樹(shù)莓葉中黃酮類化合物

葉曉珂，秦 沛，李 偉，郭 璐，唐偉偉，王 碩

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分離鑒定樹(shù)莓葉中黃酮類化合物

葉曉珂，秦 沛，李 偉，郭 璐，唐偉偉，王 碩

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

樹(shù)莓葉作為一種新的黃酮資源，為了分析鑒定其黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，采用高效液相色譜－二極管陣列－離子阱多級(jí)質(zhì)譜（HPLC-PDA-MSn）聯(lián)用技術(shù)分離鑒定樹(shù)莓葉乙醇提取物中的黃酮類化合物。通過(guò)離子阱多級(jí)質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子峰和多級(jí)碎片離子信息，分析得到了黃酮類化合物的相對(duì)分子質(zhì)量、黃酮糖苷的組成結(jié)構(gòu)、黃酮糖苷中糖的類型和多糖鏈的連接次序等。結(jié)合液相色譜相對(duì)保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照，對(duì)樹(shù)莓葉乙醇提取物中的15個(gè)黃酮類化合物的可能結(jié)構(gòu)進(jìn)行推斷。結(jié)果表明，樹(shù)莓葉中有8個(gè)槲皮素衍生化的黃酮化合物和7個(gè)山奈酚衍生化的黃酮化合物，這與樹(shù)莓中主要含有槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮化合物報(bào)道一致。

樹(shù)莓葉；黃酮類化合物；分離鑒定；液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC-MSn）；離子阱

樹(shù)莓（Rubusidaeus）是薔薇科懸鉤子屬多年生落葉小灌木植物，又名山莓、三葉泡、覆盆子、托盤(pán)、馬林、梅子、插田泡等，我國(guó)野生樹(shù)莓資源非常豐富。近年來(lái)，樹(shù)莓果作為一種新型的果品加工類型和其獨(dú)特的保健作用［1］，引起了國(guó)內(nèi)外廣泛的研究。樹(shù)莓全株都含有黃酮類化合物，尤以樹(shù)莓葉中黃酮成分最為豐富。張敏［2］測(cè)得山莓葉中總黃酮含量為1.18mg/g。Venskutonis等［3］在樹(shù)莓葉的乙醇提取物中鑒定出槲皮素-3-O-葡萄糖苷，槲皮素-3-β－葡萄糖醛酸苷，蘆丁。Lee等［4］從懸鉤子植物RhodiolasachalinensisA.Bor中分離出山奈酚。國(guó)外學(xué)者對(duì)該屬植物的黃酮類成分進(jìn)行研究，并對(duì)其中6個(gè)黃酮化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定［5］。國(guó)內(nèi)學(xué)者［6－8］從本屬植物中分離出兒茶素、山萘素苷、異鼠李素等黃酮類化合物。

目前，隨著電噴霧離子（ESI）軟電離技術(shù)的迅速發(fā)展，高效液相色譜－質(zhì)譜（HPLC/MS）聯(lián)用技術(shù)已成為分析天然產(chǎn)物復(fù)雜體系中微量化學(xué)成分強(qiáng)有力的工具。利用質(zhì)譜這個(gè)具有高靈敏度的廣譜檢測(cè)器，不僅可以獲得物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，而且還可以利用碎片離子獲得一些結(jié)構(gòu)信息，尤其是借助多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）可獲得更為詳細(xì)而系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)信息，從而實(shí)現(xiàn)黃酮等天然產(chǎn)物的在 線 結(jié) 構(gòu) 鑒 定［9－11］。袁 帥 等［12］利 用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)識(shí)別了藍(lán)莓提取物中的 黃 酮 醇 類 化 合 物。Colombo 等［13］利 用LC/MS技術(shù)研究了甘蔗渣和甘蔗葉中的黃酮類化合物，共鑒定出7種化合物。

本工作利用高效液相色譜－二極管陣列－離子阱多級(jí)質(zhì)譜（HPLC-PDA-MSn）聯(lián)用技術(shù)分析鑒定樹(shù)莓葉乙醇提取物中的黃酮類化合物，為樹(shù)莓葉中功能性活性成分的鑒定和研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LCQ液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Finnigan公司產(chǎn)品，配有Suveyor二極管陣列（PDA）檢測(cè)器、電噴霧離子源（ESI）、LCQ 離子阱（ion trap）及Xcalibur1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Hypersil GOLD色譜柱（100mm×2.1mm×3μm）：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Centrifuge 5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；Millipore超純水系統(tǒng)：美國(guó) Millipore公司產(chǎn)品；VGT-1730QT超聲波清洗儀：美瑞泰克公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

樹(shù)莓葉于10月份采摘于北京延慶樹(shù)莓種植園。

乙腈、甲醇（色譜純）：美國(guó) Merck公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇、乙酸、石油醚（分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠公司產(chǎn)品；水為經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)處理過(guò)的超純水。

1.3 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取0.500 0g樹(shù)莓葉片粉末，加入10 mLV（乙醇）∶V（水）＝75∶10的溶液，65℃超聲波中提取1h，在4℃下，4 500r/min離心分離20min，重復(fù)提取2次，收集濾液，備用。提取液用20mL石油醚反復(fù)萃取，除色素。取2.5 mL提取液，置于25mL容量瓶中，甲醇定容，稀釋10倍。取1mL上述溶液，經(jīng)0.22μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1 色 譜條 件 Hypersil GOLD 色 譜 柱（100mm×2.1mm×3μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈（A）和含0.1%乙酸的水（pH 3.2）（B）；梯度洗脫：0～5min 15%～30%A，5～10min 30%～35%A，10～15min 35%～45%A，15～20min 45%～50%A，20～25min 50%～15%A，25～35min 15%A；流速：0.2mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣量：10μL；二極管陣列檢測(cè)器（PDA）全掃描波長(zhǎng)：230～400nm。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源；毛細(xì)管溫度275℃；電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速9 L/min；輔助氣流速1.5L/min；掃描方式：負(fù)離子模式下全掃描；質(zhì)量掃描范圍：m/z100～700；離子阱多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜，選取各組分苷元為母離子（precursor ion），多級(jí)質(zhì)譜分析采用50%的碰撞歸一化能量。

2 結(jié)果與討論

標(biāo)準(zhǔn)品山奈酚的相對(duì)分子質(zhì)量為286，在負(fù)離子掃描模式下很容易丟失一個(gè)H，得到m/z285的準(zhǔn)分子離子峰［M－H］-，示于圖1a，在MS2中，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］-285失去一個(gè)中性小分子CO［M－28－H］-，得到m/z257的碎片離子；再失去一個(gè)中性小分子CH2［M－28－14－H］-，得到m/z243的碎片離子，若是失去一個(gè)中性小分子CO2［M－28－44－H］-，形成m/z213的碎片離子，示于圖1b。

標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的相對(duì)分子質(zhì)量為302，在負(fù)離子掃描模式下很容易丟失一個(gè)H，得到m/z301的準(zhǔn)分子離子峰［M－H］-，示于圖2a，在MS2中，準(zhǔn)分子離子峰［M－H］-301的C環(huán)發(fā)生逆－狄爾斯－阿爾德（RDA）裂解，易產(chǎn)生 Ai，j-和Bi，j－

離子，1/3兩個(gè)化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生 A1，3－或者 B1，3-離子，其中 A1，3－m/z151；0/4兩個(gè)化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生［B0，4＋H］-m/z179的碎片離子，示于圖2b，其斷裂方式示于圖3。

對(duì)樹(shù)莓葉乙醇提取物在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)15種黃酮類化合物，其提取質(zhì)譜總離子流圖（EIC），示于圖4。

把這15種物質(zhì)作為母離子，碰撞歸一化能量為50%，進(jìn)行二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到多級(jí)質(zhì)譜碎片信息，列于表1。通過(guò)對(duì)15種物質(zhì)的多級(jí)質(zhì)譜碎片信息分析，可以推測(cè)出這些物質(zhì)是由槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮糖苷類化合物。

2、3、4、5、6、8、14號(hào)物質(zhì)的 MS3碎片和7號(hào)物質(zhì)的MS4碎片151，179剛好與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的特征碎片離子相同，表明2、3、4、5、6、7、8、14號(hào)物質(zhì)是槲皮素衍生化的黃酮糖苷；1、9、10、12、13、15號(hào)物質(zhì)的 MS3碎片和11號(hào)物質(zhì)的MS4碎片剛好與標(biāo)準(zhǔn)品山奈酚的特征碎片離子相同，表明1、9、10、11、12、13、15號(hào)物質(zhì)是山奈酚衍生化的黃酮糖苷。

圖1 山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品在負(fù)離子掃描模式下的電噴霧質(zhì)譜圖（a）及其二級(jí)質(zhì)譜圖（b）Fig.1 ESI-MS spectrum of standard kaempfeol（a）and its MS2 spectrum（b）in negative ion mode

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品在負(fù)離子掃描模式下的電噴霧質(zhì)譜圖（a）及其二級(jí)質(zhì)譜圖（b）Fig.2 ESI-MS spectrum of standard quercetin（a）and its MS2 spectrum（b）in negative ion mode

圖3 槲皮素?cái)嗔逊绞紽ig.3 Fragmentation of quertetin

黃酮類化合物主要以游離態(tài)或者與糖結(jié)合成苷的形式存在于自然界中，在質(zhì)譜檢測(cè)中，若對(duì)其施加一定的電壓，很容易丟失中性碎片或者單（多）糖殘基，骨架上每減少一個(gè)取代基，其相對(duì)分子質(zhì)量相應(yīng)有所減少。例如，羥基減17；甲氧基減30；氧鍵相連的六碳糖減162，如葡萄糖、半乳糖；氧鍵相連的糖醛酸減176，如葡萄糖醛酸；氧鍵相連的六碳去氧糖減146，如鼠李糖；氧鍵相連的五碳糖減132，如阿拉伯糖；氧鍵相連的二糖減308，如蕓香糖。同時(shí)根據(jù)碎片斷裂的不同順序，還可以確定糖的連接次序［14］。因此，根據(jù)此規(guī)律以及文獻(xiàn)中的報(bào)道，對(duì)這15種黃酮化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷。

圖4 樹(shù)莓葉中15種黃酮化合物的提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatograms（EIC）of 15components of flavonoids in leaves of Rubusidaeus

1、9號(hào)峰，m/z都為461，即［M－H］- 為461，在1號(hào)峰的 MS2中，產(chǎn)生m/z285的二級(jí)碎片離子，即 ［M－H－176］-，失去一個(gè)葡萄糖醛酸殘基；在MS3中，m/z285的二級(jí)碎片離子產(chǎn)生m/z257的三級(jí)碎片離子，這與標(biāo)準(zhǔn)品山奈酚的碎片離子相同，因此可以推斷1、9號(hào)峰為山奈酚衍生化的黃酮糖苷。Ryan等［15］報(bào)道在樹(shù)莓中發(fā)現(xiàn)山奈酚-3-β－葡萄糖醛酸（kaempferol-3-β-glucuronide），因此1、9號(hào)峰推測(cè)為山奈酚-3-β－葡萄糖醛酸糖苷，可能由于兩者單糖殘基的空間位置不同，兩者的液相色譜相對(duì)保留時(shí)間不同，因此兩者為同分異構(gòu)體，化學(xué)式為C21H18O12，相對(duì)分子質(zhì)量為462。

2、10號(hào)峰，m/z都為447，即［M－H］-為447，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜很難進(jìn)行區(qū)別，但在MS2中，2號(hào)峰產(chǎn)生m/z301的二級(jí)碎片離子，即［MH－146］-，失去一個(gè)鼠李糖殘基；10號(hào)峰產(chǎn)生m/z285的二級(jí)碎片離子，即［M－H－162］-，失去一個(gè)葡萄糖殘基。在MS3中，2號(hào)峰的二級(jí)碎片離子m/z301產(chǎn)生m/z151，179的三級(jí)碎片離子，這與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的碎片離子相同；10號(hào)峰的二級(jí)碎片離子m/z285產(chǎn)生m/z257的三級(jí)碎片離子，這與標(biāo)準(zhǔn)品山奈酚的碎片離子相同，因此，2、10號(hào)峰分別為槲皮素和山奈酚的衍生化黃酮類糖苷。根據(jù)2號(hào)峰失去一個(gè)脫氧己糖殘基［16］即鼠李糖殘基，產(chǎn)生m/z301的二級(jí)碎片離子，推測(cè)2號(hào)峰為槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercetin-3-O-rhamnoside）；根據(jù)10號(hào)峰失去一個(gè)葡萄糖殘基，產(chǎn)生m/z285的二級(jí)碎片離子，推 測(cè) 為 山 奈 酚-3-O-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷（kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside）［17］。 因此，2、10號(hào)峰化學(xué)式為C21H20O11，相對(duì)分子質(zhì)量為448。

3、7號(hào)峰，m/z為609，即［M－H］-為609，3號(hào)峰在MS2中，產(chǎn)生m/z301的碎片離子，即［M－H－308］-，失去一個(gè)蕓香糖殘基；7號(hào)峰在MS2中，產(chǎn)生m/z447的二級(jí)碎片離子，即［M－H－162］-，在 MS3中，產(chǎn)生m/z301的三級(jí)碎片離子，即［M－H－162－146］-。根據(jù)兩者的碎片信息可知，3號(hào)峰直接產(chǎn)生m/z301的二級(jí)碎片離子，沒(méi)有出現(xiàn)任何中間碎片離子；7號(hào)峰的三級(jí)碎片離子也為m/z301的離子，但7號(hào)峰出現(xiàn)了中間碎片離子，即m/z447的二級(jí)碎片離子。3號(hào)峰的這種沒(méi)有出現(xiàn)中間碎片離子的斷裂為蕓香糖苷特有的斷裂方式，因此，3號(hào)峰推斷為槲皮素-3-O-蕓香糖苷（quercetin-3-O-rutinoside），也即蘆?。╮utin），是一種廣泛存在于植物中黃酮類化合物。根據(jù)7號(hào)峰的二級(jí)、三級(jí)碎片信息，推測(cè)為槲皮素-3-O-葡萄糖－鼠李糖苷（quercetin-3-O-glucosylrhamnoside）。兩者的化學(xué)式為C27H30O16，相對(duì)分子質(zhì)量為610。

4、8號(hào)峰，m/z都為433，即 ［M－H］- 為433，在 MS2中，產(chǎn)生m/z301的碎片離子，即［M－H－132］-，失去一個(gè)阿拉伯糖殘基或者木糖殘基。Wang等［18］報(bào)道在該屬植物Rubus pungens中 發(fā) 現(xiàn) 槲 皮 素-3-O-α－阿 拉 伯 糖 苷（quercetin-3-O-α-arabinopyranoside）。因 此，4、8號(hào)峰推測(cè)為槲皮素-3-O-α－阿拉伯糖苷，可能由于兩者單糖殘基的空間位置不同，兩者在液相色譜柱的流出時(shí)間不同，因此推測(cè)兩者為同分異構(gòu)體，化學(xué)式為C20H18O11，相對(duì)分子質(zhì)量為434。

5號(hào)峰，m/z為463，即［M－H］-為463，在MS2中，產(chǎn)生m/z為301的碎片離子，即［MH－162］-，失去一個(gè)葡萄糖基或者半乳糖基。Gudej等［19］報(bào)道在樹(shù)莓葉中發(fā)現(xiàn)有槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside），在同屬植物Rubuscoreanum中也發(fā)現(xiàn)有此類物質(zhì)。因此5號(hào)峰為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷，化學(xué)式為C21H20O12，相對(duì)分子質(zhì)量為464。

表1 樹(shù)莓葉乙醇粗提取物中黃酮類化合物保留時(shí)間、多級(jí)質(zhì)譜特征離子碎片Table 1 Retention time and fragments ions of flavonoids in leaves of Rubusidaeus

6號(hào)峰，m/z為477，即［M－H］-為477，在MS2中，產(chǎn)生m/z301的碎片離子，即［M－H－176］-，失去一個(gè)葡萄糖醛酸殘基。Lee等［20］報(bào)道在同屬植物Rubuscoreanum中發(fā)現(xiàn)槲皮素－3－β－葡萄糖醛酸（quercetin-3-β－glucuronide）。因此6號(hào)峰為槲皮素-3-β－葡萄糖醛酸糖苷，化學(xué)式為C21H18O13，相對(duì)分子質(zhì)量為478。

11、15號(hào)峰，m/z為593，即 ［M－H］- 為593，11號(hào)峰在MS2中，產(chǎn)生m/z477的二級(jí)碎片離子，即［M－H－146］-，失去一個(gè)鼠李糖殘基。在 MS3中，m/z477產(chǎn)生m/z285的三級(jí)碎片離子，即［M－H－146－162］-，失一個(gè)葡萄糖殘基。然而，15號(hào)峰在 MS2中，直接產(chǎn)生m/z285的碎片離子，即［M－H－308］-，失去一個(gè)蕓香糖殘基。根據(jù)對(duì)3、7號(hào)峰的碎片斷裂機(jī)理的討論，可以推斷11號(hào)峰為山奈酚-3-O-葡萄 糖－鼠 李 糖 苷 （kaempferol-3-O-glucosylrhamnoside），15 號(hào) 峰 為 山 奈 酚-3-O-蕓 香 糖 苷（kaempferol-3-O-rutinoside）。兩者的化學(xué)式為C26H28O15，相對(duì)分子質(zhì)量為594。

12號(hào)峰，m/z為417，即［M－H］-為417，在MS2中，產(chǎn)生m/z285的碎片離子，即［MH－132］-，失去一個(gè)阿拉伯糖殘基或者木糖殘基。Wang等［18］報(bào)道在同屬植物樹(shù)莓Rubus pungens中發(fā)現(xiàn)有山奈酚-3-O-α-L-阿拉伯糖苷（kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside）。因此12 號(hào) 峰 推 測(cè) 為 山 奈 酚-3-O-阿 拉 伯 糖 苷（kaempferol-3-O-arabinopyranoside），化學(xué)式為C19H16O10，相對(duì)分子質(zhì)量為418。

13號(hào)峰，m/z為469，即［M－H］-為469，在MS2中，產(chǎn)生m/z285的碎片離子，且m/z285的碎片離子為267、225，因此可以確定13號(hào)峰是含有山奈酚的黃酮糖苷，相對(duì)分子質(zhì)量為470。

14號(hào)峰，m/z為517，即［M－H］-為517，在MS2中，產(chǎn)生m/z301的碎片離子，即［MH－216］-，失去一個(gè)中性碎片，且m/z301的碎片離子為179、151，因此可以確定14號(hào)峰是含有槲皮素的黃酮糖苷，相對(duì)分子質(zhì)量為518。

樹(shù)莓葉乙醇提取物中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的推斷列于表2。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)樹(shù)莓葉乙醇提取物 HPLC-PDAMSn分析，檢測(cè)出15種黃酮化合物，主要是槲皮素和山奈酚衍生化的黃酮醇類化合物，這與文獻(xiàn)中的報(bào)道一致。通過(guò)對(duì)這15種黃酮化合物的一級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜碎片信息的分析，對(duì)其基本結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行初步的推斷。但對(duì)于糖基具體的空間結(jié)構(gòu)的鑒定還需要通過(guò)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行高度純化后，結(jié)合核磁等手段進(jìn)行準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)判斷。該方法簡(jiǎn)單、原料前處理便捷、同時(shí)具有靈敏度高等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)黃酮類化合物快速的初步定性研究，對(duì)于天然產(chǎn)物復(fù)雜體系中活性成分的初步定性研究也具有重要的意義。

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Separation and Identification of Flavonids of Leaves of Rubus idaeus by High Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization Multi-Stage Tandem Mass Spectrometry

YE Xiao-ke，QIN Pei，LI Wei，GUO Lu，TANG Wei-wei，WANG Shuo
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457）

To analysis and determinate the construction of flavonids in the leaves of raspberry as a new flavonids resource，the utility of high performance liquid chromatograph in combined with photodiode array detection and mass spectrometer technology （HPLC-PDAMSn）was successfully applied to simultaneous separate and determinate 15flavonoides in ethanol extracts of leaves ofRubusidaeus.It was analyzed that constructions of flavonoid aglycones，the types of glycogen，sequences of polysaccharide using the information of molecular weight and ion fragmentations of MSnprovided by ion trap.In addition to liquid chromatography retention time，standard materials and published reports，the possible construction of 15flavonoids in ethanol extracts was inferred.The result shows that it contains 8quercetin derivatives and 7kaempferol derivatives，which was corresponded with the pub-lished reports.

leaves ofRubusidaeus；flavonoids；separation and determination；HPLC-MSn；ion trap

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0271-07

2011-01-15；

2011-06-14

葉曉珂（1986～），女（漢族），河南漯河人，碩士研究生，食品科學(xué)專業(yè)。E-mail：yexiaoke1986＠sina.com

王 碩（1969～），男（漢族），天津人，博士生導(dǎo)師，從事食品營(yíng)養(yǎng)與安全研究。E-mail：s.wang＠tust.edu.cn