正交試驗(yàn)優(yōu)選天麻的提取工藝

張 震,張長(zhǎng)林

(1.山東省藥學(xué)會(huì),山東濟(jì)南 250101;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250014)

天麻為蘭科植物天麻 Gastrodia elataBL.的干燥塊莖。具有息風(fēng)止痙,平抑肝陽(yáng),祛風(fēng)通絡(luò)的功能。天麻中含有天麻素(gastrodin即天麻苷),對(duì)羥基苯甲醇,β-谷甾醇,蘿卜苷,檸檬酸,檸檬酸單甲酯,棕櫚酸,對(duì)羥基苯甲醛,香莢蘭醛(香莢蘭素),香莢蘭醇等。其中天麻素為 4-羥甲基苯 -β -D-葡萄砒喃糖苷,具有鎮(zhèn)靜、麻醉、抗驚厥的作用,為天麻的主要活性成分[1～4]。香莢蘭素、香莢蘭醇亦有鎮(zhèn)靜、抗驚厥的作用[1]。本研究采用正交試驗(yàn),天麻素的提取率、出膏率為考察指標(biāo),對(duì)乙醇濃度、加醇量、提取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)選,確定天麻的適宜提取工藝。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀 (美國(guó)Waters公司),檢測(cè)器為Waters 2487二級(jí)管陣列檢測(cè)器,泵 Waters 600,控制器為 Waters 600,數(shù)據(jù)處理器為L(zhǎng)C系統(tǒng)化學(xué)工作站。天麻素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,批號(hào)為 110807-200205。天麻藥材采購(gòu)于濟(jì)南市建聯(lián)藥材公司,由山東省中醫(yī)藥研究院鐘方曉研究員鑒定為蘭科植物天麻 Gastrodia elata BL.的干燥塊莖,粉碎為小塊備用。所用試劑乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)乙醇濃度、加乙醇量、提取次數(shù)三因素進(jìn)行考察,因素水平設(shè)計(jì)見表 1。采用 L9(34)正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)。每次試驗(yàn)各取天麻藥材 8 g,精密稱定,回流提取,濾過(guò),分別以相應(yīng)濃度的乙醇定容至 250 mL量瓶中。

表1 因素水平

2.2 出膏率測(cè)定 分別精密量取各份提取液 50 mL,平行取2份,置已恒重的蒸發(fā)皿中,蒸干后,105℃干燥 3 h,冷卻后稱重,計(jì)算出膏率。

2.3 色譜條件 流動(dòng)相:乙腈 -0.05%磷酸 (3∶97);流速:1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;進(jìn)樣量:10μL;柱溫:室溫。天麻藥材提取液及對(duì)照品的HPLC色譜圖見圖 1。

2.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱取天麻素對(duì)照品 8.24 mg,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,濃度為0.329 6 mg·mL-1,作為對(duì)照品貯備液。精密吸取 2 mL于10 mL量瓶中,加流動(dòng)相至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液,濃度為 65.92μg·mL-1。

圖1 HPLC圖譜A對(duì)照品、B天麻藥材

2.5 天麻藥材溶液的制備 取天麻,粉碎,取粉末 (過(guò) 4號(hào)篩)約 0.8 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入 60%乙醇50 mL,稱定重量,加熱回流提取 3 h,放冷再稱定重量,濾過(guò),取續(xù)濾液 10 mL,濃縮至近干,殘?jiān)右译?-水 (3∶97)混合液溶解,轉(zhuǎn)移至 10 mL量瓶中,并用乙腈 -水 (3∶97)混合溶液稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.6 供試品溶液的制備 精密吸取各份天麻藥材提取液 10 mL,水浴蒸干,以乙腈 -水(3∶97)混合液溶解,轉(zhuǎn)移至 25 mL的量瓶中,加乙腈 -水(3∶97)至刻度,搖勻,以 0.45μm的濾膜濾過(guò),作為供試品溶液。

2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品貯備液 0.5、1、2、3、4 mL于 10 mL量瓶中,加流動(dòng)相至刻度搖勻,即得。分別進(jìn)樣 10μL,按上述色譜條件,測(cè)定峰面積積分值,對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,回歸方程為 Y=970 5X-153.05,r=0. 999 6。結(jié)果表明天麻素進(jìn)樣量在 0.164 8～1.318μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液 10μL,連續(xù)進(jìn)樣 5次,測(cè)定峰面積積分值,結(jié)果 RSD為 0.84%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一供試品溶液放置 0、2、4、6、8 h,按照上述色譜條件,進(jìn)樣 10μL進(jìn)行測(cè)定,記錄峰面積積分值,結(jié)果 RSD為 1.06%,表明供試液 8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取正交試驗(yàn)的 1號(hào)試驗(yàn)液,按照供試品溶液的制備方法,進(jìn)行 6份平行試驗(yàn),并計(jì)算 1號(hào)試驗(yàn)液中天麻素的含量,結(jié)果 RSD為 1.30%。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取 1號(hào)試驗(yàn)液 5 mL,分別精密加入天麻素對(duì)照品 0.126 mg,按照供試品溶液的制備方法,制備回收率試驗(yàn)液,依法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算平均回收率為98.68%,RSD為 0.907%,結(jié)果見表 2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.12 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 取各供試品溶液 10μL注入液相色譜儀,依法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算各試驗(yàn)樣品天麻素的轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表 3,方差分析見表 4。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

試驗(yàn)結(jié)果直觀分析可見,各因素對(duì)天麻素的提取率稍有差異,C＞B＞A,A對(duì)出膏率影響為主要因素,C、B對(duì)出膏率影響為次要因素;方差分析統(tǒng)計(jì)表明 A、B、C三因素對(duì)天麻素提取率的影響均不顯著,A對(duì)出膏率的影響顯著,且以A1為最佳,綜合天麻素提取率及出膏率及生產(chǎn)成本,選擇A1B1C1,即以 60%的乙醇,回流提取 2次,每次加入 6倍量。2.13 工藝驗(yàn)證 取 3份天麻藥材,每份 8 g,精密稱定,分別加入 60%乙醇,回流提取 2次,每次加入6倍量乙醇,同上操作,測(cè)定天麻素的提取率及出膏率,結(jié)果見表 5。

表5 工藝驗(yàn)證結(jié)果

工藝驗(yàn)證結(jié)果表明,通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的天麻提取工藝天麻素的提取率較高、工藝穩(wěn)定、科學(xué)合理。因此,確定天麻的提取工藝為 60%的乙醇,加入6倍量,回流提取2次,每次 2 h。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的乙醇提取后直接取樣測(cè)定,考察了乙醇濃度、提取次數(shù)、加乙醇量對(duì)天麻素提取率的影響,至于濃縮、干燥方式對(duì)浸膏中天麻素含量的影響有待研究。

本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC法測(cè)定天麻提取液中天麻素的含量,方法學(xué)考察表明天麻素分離良好,進(jìn)樣量在 0.164 8～1.318 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系,平均回收率為98.68%,RSD為 0.907%。

[1] 陰健,郭力弓.中藥現(xiàn)代研究與臨床應(yīng)用Ⅰ[M].北京:學(xué)苑出版社,1993:140.

[2] 國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:486.

[3] 尚偉芬,于澍仁.天麻藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥, 1997,28(10):629-632.

[4] 楊世林,蘭進(jìn),徐錦堂.天麻的研究進(jìn)展[J].中草藥, 1999,31(1):66-69.