DNA分子力學(xué)性質(zhì)的測量

冉詩勇，王艷偉，楊光參

（溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院物理實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州325035）

1 引 言

生物學(xué)與物理學(xué)的相互交融自20世紀(jì)以來已是大勢所趨.DNA作為生物學(xué)中最重要的大分子，同時(shí)受到了物理學(xué)家和生物學(xué)家的關(guān)注.生物學(xué)家更關(guān)注DNA作為遺傳密碼的生物學(xué)功能，而物理學(xué)家則將之看做受彈性理論和聚電解質(zhì)理論支配的帶負(fù)電的高分子.雖然各自關(guān)注的重點(diǎn)不一，但兩者之間存在密切聯(lián)系.DNA的力學(xué)性質(zhì)直接影響到了其生物學(xué)功能，例如在DNA重組過程中，DNA必須被拉長到其正常的右螺旋態(tài)的大約1.5倍長.

20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的單分子生物物理研究則為生物學(xué)家和物理學(xué)家架設(shè)了一個(gè)很好的互通橋梁.這一領(lǐng)域通常利用單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如光鑷、磁鑷等）操縱單根DNA分子，探索如DNA力學(xué)性質(zhì)，DNA與蛋白相互作用等雙方都關(guān)注的科學(xué)問題[1－3].目前這一領(lǐng)域仍在蓬勃發(fā)展中，及時(shí)地向物理學(xué)背景的研究生以及本科生介紹這一領(lǐng)域顯得尤為必要.

近年來，我們在近代物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中利用自行研制的單分子磁鑷裝置，以測量單根DNA的力學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，以觀測DNA與各種作用因子作用為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，開設(shè)了單分子生物物理綜合設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn).這一實(shí)驗(yàn)既涉及到了生物學(xué)中的重要的DNA大分子，又應(yīng)用了屬于研究前沿的單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而物理學(xué)原理則是基本的熱力學(xué)的能量均分定理.該實(shí)驗(yàn)可以很好地讓學(xué)生與研究前沿接軌，并對(duì)物理學(xué)在生物學(xué)中的應(yīng)用有初步的認(rèn)識(shí).

2 實(shí)驗(yàn)裝置與實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示.整個(gè)實(shí)驗(yàn)在一倒置顯微鏡（Nikon－TE2000U）上進(jìn)行.樣品池（圖2）由2片載玻片夾住1片側(cè)面拋光的蓋玻片并用玻璃膠密封構(gòu)成.上面載玻片鉆有2個(gè)直徑約1mm的小孔，玻璃管從小孔中接出并與硅膠管相連，一根硅膠管連接微注射泵，另一根接樣品溶液.通過調(diào)節(jié)微注射泵（保定蘭格）的流速和拉伸方式，可使樣品進(jìn)入或流出樣品池.一端帶有磁球而另一端帶有地高辛的DNA溶液引入后可通過地高辛和抗地高辛之間的特異結(jié)合，連接在鋪好抗地高辛的拋光蓋玻片側(cè)壁上，形成如圖3所示結(jié)構(gòu).樣品池一側(cè)有安裝在手動(dòng)微操縱儀上的永磁鐵，通過吸引磁球?qū)NA施加拉力，可以通過改變永磁鐵的位置來改變磁力大小.樣品池內(nèi)顯微鏡成像通過外接CCD（維視圖像，VS－808HC）以每秒25幀成像實(shí)時(shí)傳送到計(jì)算機(jī)主機(jī)上安裝的圖像采集卡（微視圖像，MV－200），并錄像保存視頻供分析.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置圖

圖2 樣品池

圖3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

磁球在焦平面x方向的運(yùn)動(dòng)相當(dāng)于阻尼擺運(yùn)動(dòng).熱漲落傾向于讓小球偏離平衡位置δx，導(dǎo)致x方向回復(fù)力Fx＝－Fsinθ與之抗衡，這里θ為擺偏離平衡位置夾角，F(xiàn)為垂直于x方向的外力.由于θ較小，sinθ≈θ＝δx／〈L〉，于是有Fx≈－Fδx／〈L〉＝－kxδx，其中〈L〉為DNA的末端距長度即磁球到側(cè)壁的距離，kx＝F／〈L〉是該阻尼擺的有效勁度.這樣擺的小角度的x方向運(yùn)動(dòng)可以看作一維諧振子運(yùn)動(dòng)，其能量等于kx〈δx2〉／2，而根據(jù)能量均分定理，小球在垂直磁場方向即x方向自由度上的能量為KBT／2，這樣KBT／2＝kx〈δx2〉／2＝F〈δx2〉／（2〈L〉），得到：

其中KB為玻爾茲曼常量，T為熱力學(xué)溫度，〈δx2〉為磁球布朗運(yùn)動(dòng)x方向的均方差[4－6].磁球的運(yùn)動(dòng)軌跡利用基于快速傅里葉變換的自相關(guān)算法程序[6]分析采集的視頻得到.δx和〈L〉可通過圖像分析直接得到，并通過（1）式求得外力大小.

磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液的配制方法：16mL 0.2mmol／L的NaH2PO4·2H2O與84mL 0.2mmol／L的Na2HPO4·12H2O混合得到100mL的PBS溶液，再加入NaCl達(dá)到140mmol／L.然后對(duì)其進(jìn)行過濾以待用.該緩沖液的pH值為7.5.

DNA樣品制備：采用lambda DNA（New England Biolab）用于實(shí)驗(yàn)，其兩端各有12個(gè)堿基的缺口，定制與缺口互補(bǔ)并且分別修飾有生物素和地高辛功能基的12個(gè)堿基的寡核酸片斷，利用T4連接酶將2個(gè)片斷互補(bǔ)連上得到兩端修飾的DNA[7].實(shí)驗(yàn)時(shí)先將DNA與2.8μm修飾有鏈親和素的順磁球（dynal biotech）混合，因?yàn)樯锼嘏c鏈親和素能夠形成共價(jià)鍵，這樣就得到了連有磁球的DNA.

3 結(jié)果與討論

圖4為分析得到的不同外力下磁球在平行于側(cè)壁方向的運(yùn)動(dòng)軌跡，其波動(dòng)幅度直接反映了所受外力的大小.可以觀察到施加外力越大，波動(dòng)幅度越??；反之則越大.對(duì)δx2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)平均得到〈δx2〉，進(jìn)一步由式（1）可求出此時(shí)DNA所受的力的大小.對(duì)圖4所示的各種外力下的δx進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，可以得到其各自的統(tǒng)計(jì)分布圖，如圖5所示.可以看到δx的分布滿足典型的高斯分布.力越大，分布峰值越高，半峰全寬也越窄.作為一種輔助手段，觀察δx分布是否滿足高斯分布可以判斷所采集的數(shù)據(jù)幀是否足夠多，以用于準(zhǔn)確計(jì)算δx2的統(tǒng)計(jì)平均值.

圖4 不同外力作用下磁球在平行于側(cè)壁方向的運(yùn)動(dòng)軌跡圖

圖5 對(duì)應(yīng)于圖4的不同外力下δx的統(tǒng)計(jì)分布（圖中每個(gè)柱狀的寬度均為0.02μm）

通過移動(dòng)磁鐵改變施加的力的大小，得到了一系列DNA相對(duì)伸長量L／L0（L0為DNA完全拉直后的輪廓長度，lamnda DNA約為16.4μm）隨外力變化的數(shù)據(jù).

在0.1～10pN范圍內(nèi)，DNA的力學(xué)反應(yīng)行為可以用蠕蟲狀鏈（worm－like－chain，WLC）模型來描述[8].根據(jù)該模型為：

其中KB是玻爾茲曼常量，T是熱力學(xué)溫度，L0是DNA完全舒展時(shí)的長度，F(xiàn)為外力，L是DNA的末端距長度，A為DNA的持久長度，是高分子物理學(xué)中用來衡量高分子剛性的一個(gè)參量.在0.2mmol／L PBS＋140mmol／L NaCl的溶液環(huán)境中，DNA的持久長度A為50nm左右.代入A值，室溫T＝298K后，作圖得到該模型函數(shù)圖，如圖6實(shí)線所示，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合良好.

圖6 測量得到的不同外力下DNA的相對(duì)伸長數(shù)據(jù)以及蠕蟲狀鏈模型擬合曲線

由于該測力方法原理是基于統(tǒng)計(jì)平均，不可避免地會(huì)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)誤差.如果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)量不足，則會(huì)造成測量的偏差.一般數(shù)據(jù)采集量宜至少大于1 500個(gè)，即采集分析1min幀率25幀／s的視頻數(shù)據(jù)，才能較好地控制偏差.采集時(shí)間超過2min即3 000幀數(shù)據(jù)后，其測力偏差不超過5%.此外，當(dāng)所施加的磁力小于0.5pN時(shí)，由于磁球會(huì)靠近側(cè)壁，側(cè)壁表面可能會(huì)與之作用從而影響測量，因此實(shí)際測量中，一般將DNA的末端距長度保持在大于9μm.

在教學(xué)過程中，學(xué)生親自動(dòng)手采集不同磁力大小下的實(shí)驗(yàn)視頻，然后離線分析，得到DNA所受力的大小及DNA的末端距平均長度，畫出如圖6所示的數(shù)據(jù)圖，然后與蠕蟲狀鏈模型相對(duì)照.

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步面向?qū)W生開展DNA與各種作用因子相互作用等直接面向科研的設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)研究.通過向樣品池中導(dǎo)入可以與DNA相互作用的蛋白、活性劑等作用因子，分析磁球的運(yùn)動(dòng)可得到DNA末端距隨時(shí)間變化的曲線.分析這些曲線可以直接得到其作用機(jī)理和形成的結(jié)構(gòu)信息.具體的研究實(shí)例可以參見文獻(xiàn)[9]和[10].

4 結(jié)束語

介紹了DNA力學(xué)性質(zhì)測量的近代物理實(shí)驗(yàn).該實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)學(xué)生動(dòng)手和數(shù)據(jù)處理能力的同時(shí)，加深物理學(xué)專業(yè)學(xué)生對(duì)生物與物理相互交融趨勢的理解，對(duì)具體的生物物理科學(xué)研究有初步的感性認(rèn)識(shí).

[1] 冉詩勇，孫博，李明.單分子操縱與單分子生物物理[J].物理，2007，36（3）：228－235.

[2] Ran Shi－yong，Wang Xiao－ling，F(xiàn)u Wen－bo，et al.Single molecule DNA compaction by purified his－tones[J].Chinese Science Bulletin，2008，53（6）：836－841.

[3] 王曉玲，張興華，魏孔吉，等.一種改進(jìn)型單分子操縱裝置及其應(yīng)用[J].物理學(xué)報(bào)，2008，57（6）：3905－3911.

[4] Strick，T R，Allemand J F，Bensimon D，et al.Behavior of supercoiled DNA[J].Biophysical Journal，1998，74（4）：2016－2028.

[5] 王誠泰.統(tǒng)計(jì)物理學(xué)[M].北京：清華大學(xué)出版社，1991：343－345.

[6] Feyman R P，Leighton R B，Sands M.費(fèi)恩曼物理學(xué)講義（第一卷）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：422－423.

[7] Smith S B，F(xiàn)inzi L，Bustamante C.Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads[J].Science，1992，258：1122－1126.

[8] Bustamante C，Marko J F，Siggia E D，et al.Entropic elasticity ofλ－phage DNA[J].Science，1994，265：1599－1600.

[9] Ran Shi－yong，Wang Yan－wei，Yang Guang－can，et al.Morphology characterization and single－molecule study of DNA－dodecyltrimethylammonium bromide complex[J].Journal of Physical Chemistry B，2011，115（16）：4568－4575.

[10] Wang Yan－wei，Ran Shi－yong，Man Bao－yuan，etal.Ethanol induces condensation of single DNA molecules[J].Soft Matter，2011，7：4425－4434.