辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的分離鑒定及降解特性研究

張 諤，俞國平

（同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海200092）

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol polyethoxylates，APEOn），例如辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）是重要的非離子表面活性劑。研究發(fā)現(xiàn)，APEOn的生物降解產(chǎn)物烷基酚（alkylphenol，AP）、烷基酚乙烯醚低聚物APEO1和APEO2等具有內(nèi)分泌干擾物活性［1－4］，其中辛基酚（Octylphenol，OP）是APEOn降解產(chǎn)物中環(huán)境雌激素活性最強(qiáng)的［5－6］，其雌激素效應(yīng)比壬基酚強(qiáng)40余倍［7］。本研究從農(nóng)田土壤及池塘水中分離得到2株OPEOn降解菌，并對(duì)其進(jìn)行了16SrDNA鑒定和降解性能試驗(yàn)考察，旨在揭示OPEOn生物降解規(guī)律，以期為OPEOn污染的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）（AMRESCO公司），商品名Triton X－100，Reagent Grade，由各種不同支鏈的同分異構(gòu)體組成，乙氧基平均鏈長為9.5。

1.2 菌種富集、分離純化和培養(yǎng)基組成

試驗(yàn)樣品于2006年11月取自上海市閔行區(qū)幸福村農(nóng)田土壤及池塘水，共11份。

配制無機(jī)鹽溶液（g／L）：NaCl（2.5），（NH4）2SO4（2.0），MgSO4·7H2O（0.3），CaCl2（0.01），Na2HPO4（3.7），KH2PO4（0.9），Vitamin溶液：2mL／L，Trace element溶液：1mL／L，pH值為6.8～7.0。

Vitamin溶液成分如下（mg／L）：pyridoxine hydrochloride（10.0），riboflavin（5.0），thiamine hydrochloride（5.0），nicotinic acid（5.0），lipoic acid（5.0），p－aminobenzoic acid（5.0），biotin（2.0），folic acid（2.0），vitamin B12（0.1）。

Trace element溶液的成分如下（mg／L）：MnCl2· H2O（20.0），CoCl2·6H2O（4.0），Na2MO4·2H2O（26.0），F(xiàn)eCl3·6H2O（15.0），配好后經(jīng)高壓滅菌（120℃，20min）備用。

1.3 16SrDNA擴(kuò)增和序列測定

收集菌體，提取DNA作為擴(kuò)增模板。16SrDNA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)所用的正向引物Pf：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；反向引物Pr：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′，分別對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的16SrRNA基因的8－27和1492－1510堿基。引物合成及測序工作由上海基康生物技術(shù)有限公司完成，PCR反應(yīng)體系（25μL）為：10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2（25mM）1μL，dNTP（2.5 mM）1μL，引物各0.5μL，模板DNA 1μL，Taq酶（5U／μL）0.25μL，重蒸水18.25μL。

1.4 OPEOn降解菌生長曲線及總有機(jī)碳的測定

OPEOn降解菌生長曲線的測定采用WFJ7200型可見分光光度計(jì)，測定菌液的OD600值。

菌液中未被降解的OPEOn的含量采用TOC儀測定。菌液在高速離心機(jī)中以4 000r／mim離心5min后，取上清液按比例稀釋后測定TOC值。TOC儀為Multi N／C 3000TOC／TN Analyzer，進(jìn)樣量20mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 OPEOn降解菌的分離

使用以O(shè)PEOn為唯一碳源的培養(yǎng)基，對(duì)11份土壤及池塘水樣進(jìn)行4個(gè)月馴化后，生長明顯的3份進(jìn)行固體平板劃線分離，挑取單菌落，反復(fù)劃線純化，共分離得到3株可降解OPEOn的菌株。測定5d內(nèi)對(duì)100mg／L OPEOn的降解能力，結(jié)果如表1所示，其中以菌株X－4及X－6的降解率最高，因此選擇X－4及X－6作為進(jìn)一步研究的菌種。

表1 OPEOn降解菌的降解率

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及生化鑒定

菌株X－4菌落直徑大小為1～1.5mm，圓形，邊緣整齊，有光澤，呈淡黃色，精氨酸雙水解酶反應(yīng)呈陰性，革蘭氏反應(yīng)呈陽性；菌株X－6菌落直徑大小為1～1.5mm，圓形，邊緣整齊，有光澤，呈乳白色，半透明，精氨酸雙水解酶反應(yīng)呈陰性，革蘭氏反應(yīng)呈陰性。

2.2.2 16SrDNA序列測序結(jié)果分析

菌株X－4的16SrDNA共測得1 453個(gè)堿基，X－6為825個(gè)堿基，所得序列在GenBank上登錄，登錄號(hào)分別為DQ 286 360.1及AY 987 735.1／AM 184 292.1。結(jié)果表明，菌株X－4與菌種Bacillus sphaericus親源關(guān)系最近，二者的16SrDNA的相似性為99%。菌株X－6與菌株Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata親源關(guān)系最近，X－6與2菌株的16SrDNA的相似性均為99%。結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生化特征，菌株X－4初步鑒定為Bacillus sphaericus，X－6為Aeromonas hydrophila或Aeromonas punctata。

2.3 接種量對(duì)OPEOn降解的影響

在一系列初始pH值為7.0的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別以0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的接種量分別接入X－4，X－6菌體，OPEOn初始濃度均為20 mg／L，置于30℃，150r／min搖床避光培養(yǎng)，每24h取樣1次，測定其TOC值。接種量對(duì)菌株X－4，X－6降解OPEOn的影響見圖1和圖2。

圖1 接種量對(duì)菌株X－4降解能力的影響

圖2 接種量對(duì)菌株X－6降解能力的影響

由圖1和圖2可見，接種量在0.5%～2.0%時(shí)，降解OPEOn的速率和起始接種量呈正相關(guān)。考慮到本試驗(yàn)中單純使用以TOC值表征的OPEOn含量的變化并不能說明不同接種比下，OPEOn的降解效率，故自定義“接種效率”概念，“接種效率”的計(jì)算方法如下：

由此公式可以計(jì)算得出：菌株X－4在接種比為1.0%時(shí)，“接種效率”最高，達(dá)到22.9%；菌株X－6在接種比為1.5%時(shí)，“接種效率”最高，達(dá)到22.0%。此外，當(dāng)接種比為1.0時(shí)，X－6的“接種效率”為21.2%。在本次試驗(yàn)中，為簡化操作，設(shè)定2菌株的接種比均為1.0%。

2.4 OPEOn培養(yǎng)基濃度對(duì)降解的影響

配制OPEOn濃度分別為5，20，50，100，200，1 000mg／L的OPEOn培養(yǎng)基，溶劑為無機(jī)鹽溶液，pH值為7.0。菌株X－4及X－6均以1%的接種比接入各濃度培養(yǎng)基。接菌后置于30℃，150r／min搖床避光培養(yǎng)，每24h取樣1次，并測TOC值。OPEOn濃度對(duì)菌株X－4及X－6降解OPEOn的影響見圖3和圖4。

圖3 OPEOn濃度對(duì)菌株X－4降解能力的影響

圖4 OPEOn濃度對(duì)菌株X－6降解能力的影響

由圖3和圖4可見，菌株X－4及X－6均在培養(yǎng)基OPEOn濃度為20mg／L時(shí)，達(dá)到最高降解率。Boopathy［8］曾指出，培養(yǎng)基中有機(jī)物含量過高，會(huì)對(duì)菌體生長產(chǎn)生抑制作用或毒害作用，太低則會(huì)限制菌體的生長。Hsi－Jien Chen［9］等研究了5種OPEOn降解菌的降解性能，所使用培養(yǎng)基中OPEOn濃度范圍為0.1mg／L～100 000mg／L，5種OPEOn降解菌生長的最適OPEOn濃度，最低質(zhì)量濃度為100mg／L，最高質(zhì)量濃度為10 000mg／L。

2.5 pH值對(duì)OPEOn降解的影響

分別將OPEOn濃度為20mg／L的培養(yǎng)基調(diào)pH值至5.0，6.0，6.5，7.0，7.3，7.5，8.0，8.5，9.0，以1%的接種比接入菌株X－4及X－6，于30℃，150 r／min搖床避光培養(yǎng)5d，測其OD 600值。和大多數(shù)生物體一樣，細(xì)菌對(duì)胞內(nèi)外環(huán)境pH值都有一定的要求。pH值對(duì)菌株X－4及X－6降解OPEOn的影響見圖5和圖6。

圖5 pH值對(duì)菌株X－4降解能力的影響

圖6 pH值對(duì)菌株X－6降解能力的影響

圖5和圖6表明，菌株X－4及X－6均可以在pH值為6.0～8.5的范圍內(nèi)降解OPEOn。在pH值為7.3～7.5時(shí)，2菌株對(duì)OPEOn的降解率最高，這可能是由于2菌株均于冬季取自農(nóng)田土壤及池塘，而此季節(jié)動(dòng)植物及微生物新陳代謝緩慢，酸性物質(zhì)產(chǎn)生較少，故土壤偏堿性，因此其中存在的微生物適應(yīng)在中性偏堿性環(huán)境下生長［10］。

2.6 溫度對(duì)OPEOn降解的影響

配制OPEOn質(zhì)量濃度為20mg／L，pH值為7.5的培養(yǎng)基，以1.0%的接種比接入菌株X－4及X－6，分別于10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，150r／min搖床避光培養(yǎng)5d，每12h取樣測其OD 600值，結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 溫度對(duì)菌株X－4降解能力的影響

圖8 溫度對(duì)菌株X－6降解能力的影響

由圖7和圖8可知，2菌株對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)能力要強(qiáng)于高溫環(huán)境，可能與菌株采集的時(shí)間是在冬季有關(guān)，故2菌株可能有較強(qiáng)的抗寒能力。2菌株在10～40℃之間都有明顯的生長，但在50℃以上時(shí)，菌株生長基本已停止。2菌株的最適生長溫度為30℃，此時(shí)，菌株的降解率達(dá)到最大，X－4為26%，X－6為32%。Mann［11］等研究了OPEOn在污水處理系統(tǒng)中的生物降解性，發(fā)現(xiàn)OPEOn的生物降解性從3月的26%升高到8月末9月初的80%，而從10月到第2年的1月其降解性降低到20%～25%。他們認(rèn)為生物降解性的這種隨時(shí)間的變化受溫度對(duì)生物活性的控制。在冷冬，溫度低，生物降解性降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符。Nasu［12］和Maruyama［13］等人對(duì)壬基酚聚氧乙烯醚（NPEOn）生物降解的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.7 降解動(dòng)力學(xué)分析

對(duì)菌株X－4及X－6在不同OPEOn濃度下的降解率進(jìn)行數(shù)學(xué)分析。

建立Monod模型，得到一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式為：lnc＝－kt＋A

式中：c為OPEOn的質(zhì)量濃度，mg／L，k為OPEOn降解速率的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；t為生物降解時(shí)間，d；A為常數(shù)；y為OPEOn的降解率。

運(yùn)用MATLAB對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了計(jì)算和分段擬合（見表2，表3）。

表2 不同初始濃度下X－4對(duì)OPEOn生物降解的動(dòng)力學(xué)方程

表3 不同初始濃度下X－6對(duì)OPEOn生物降解的動(dòng)力學(xué)方程

結(jié)果表明，2菌株的降解反應(yīng)均在低濃度（5，20，50，100mg／L）時(shí)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征，所得的動(dòng)力學(xué)方程能較好地描述試驗(yàn)中的反應(yīng)趨勢(shì)，而在較高底物濃度（200，1 000mg／L）下降解反應(yīng)并不符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，2菌株對(duì)OPEOn的降解率均在初始濃度為20mg／L時(shí)達(dá)到最大值，其中X－4為26%，X－6為32%。這表明微生物降解OPEOn的過程存在一個(gè)合適的降解濃度，底物一方面可以誘導(dǎo)降解酶活性的提高，另一方面也抑制細(xì)菌的生長和生理活動(dòng)，需充分考慮OPEOn濃度與微生物數(shù)量的關(guān)系。

另外，從圖3及圖4還可以看出，各濃度下OPEOn的降解率在3d以后變化緩慢，OPEOn濃度基本不再發(fā)生變化，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的可能原因?yàn)椋弘S著降解過程的進(jìn)行，溶液中出現(xiàn)了較OPEOn更難降解的中間產(chǎn)物，如OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2等短乙氧基鏈化合物。由于苯環(huán)的存在，OP，OPEO 1，OPEO 2，OPEC 1，OPEC 2在環(huán)境中具有很高的穩(wěn)定性，不易被降解［14］，且具有更強(qiáng)的環(huán)境雌激素效應(yīng)［15］。當(dāng)其濃度累積到一定水平時(shí)會(huì)對(duì)微生物產(chǎn)生抑制。本課題目前只對(duì)OPEOn降解菌的降解特性進(jìn)行了研究，進(jìn)一步的研究應(yīng)該包括對(duì)降解菌液進(jìn)行分析，確定降解產(chǎn)物，以便構(gòu)建2菌株對(duì)OPEOn的降解途徑。

3 結(jié) 論

（1）從上海閔行幸福村農(nóng)田土壤及池塘水中分離得到2株能夠降解內(nèi)分泌干擾物辛基酚聚氧乙烯醚（OPEOn）的菌株X－4及X－6，初步鑒定X－4為球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus），X－6為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）或點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌點(diǎn)狀亞種（Aeromonas punctata）。

（2）菌株X－4降解OPEOn的最佳條件是接種量為1.0%，初始pH值為7.3～7.5，溫度為30℃；X－6是接種量為1.5%，初始pH值為7.3～7.5，溫度為30℃。

（3）菌株X－4及X－6對(duì)OPEOn的降解反應(yīng)在低濃度（5，20，50，100mg／L）時(shí)符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征，而在較高底物濃度（200，1 000mg／L）下不能用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)描述，2菌株對(duì)OPEOn的降解率在初始濃度為20mg／L時(shí)達(dá)到最大值，其中X－4為26%，X－6為32%。

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