小球藻生長動力學特征研究

封 麗，張 君，穆 斌，劉 敏

（1.重慶市環(huán)境科學研究院，重慶401147；2.萬盛區(qū)環(huán)境保護局，重慶400800；3.重慶市農(nóng)業(yè)機械鑒定站，重慶402160）

小球藻（Chlorella vulgaris）為綠藻門（Chlorophyta）小球藻屬（Chlorella）普生性單細胞藻，屬富營養(yǎng)型藻類，喜歡有機質(zhì)豐富的水體［1－3］。斯托姆曾對藻類的化學成分進行過分析研究，提出藻類的“經(jīng)驗分子式”為C106H263O100N16P［4］。根據(jù)李比希最小定律，不難理解藻類的生殖量將主要取決于水環(huán)境中P和N的供應(yīng)量。當P或N供應(yīng)充足時，藻細胞將充分增殖；如果P或N供應(yīng)量受到限制，那么藻類增殖將受到限制。在藻類種群動態(tài)研究中，Monod方程與Droop方程是2個將營養(yǎng)鹽的可利用性與微生物生長直接聯(lián)系起來的基本動力學方程［5］。一些研究者用Monod方程分析了營養(yǎng)鹽濃度對鼓藻（Cosmarium abbreviatum）、斜生柵藻（Scendesmus obliquus）和銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）等藻類生長的影響［6－7］。這里則以小球藻為研究對象，在微生物生長動力學的基礎(chǔ)上研究了N，P對小球藻生長的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

生物倒置熒光顯微鏡、分光光度儀、自動電熱壓力蒸汽滅菌器、數(shù)控超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱、離心機和血球計數(shù)板等。試驗所需所有玻璃儀器均用超聲波清洗器洗凈，在0.1mg／L稀鹽酸中浸泡30min以上，用新鮮去離子水沖洗干凈，在121℃高壓下蒸汽滅菌，烘干后備用。

1.2 藻種及培養(yǎng)基

小球藻購自中科院武漢水生生物研究所（FACHB編號6）。

BG－11培養(yǎng)基的配制［6］：硝酸鈉1.5g／L，磷酸氫二鉀40mg／L，硫酸鎂75mg／L，氯化鈣36mg／L，檸檬酸6mg／L，檸檬酸鐵銨6mg／L，乙二胺四乙酸1mg／L，碳酸鈉20mg／L，微量金屬離子溶液1mL：硼酸2.86g／L，氯化錳1.81g／L，鉬酸鈉0.39g／L，硫酸銅0.079g／L，硫酸鋅0.222g／L，硝酸鈷0.049 g／L。整個試驗以上述培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用新鮮去離子水配制成無磷或無氮培養(yǎng)基，按試驗所需質(zhì)量濃度加入相應(yīng)量的P或N。pH值均調(diào)節(jié)到7.4。

1.3 營養(yǎng)鹽初始濃度控制

P質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.000，0.002，0.010，0.040，0.200，0.400，0.800，2.000，4.000，8.000，16.000mg／L。

N質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.000，0.050，0.200，0.800，3.200，6.400，12.800，51.200，102.400，153.600，460.800mg／L。

氮磷比（N／P）的濃度設(shè)置：P濃度固定為0.2 mmol／L；比值梯度為0，5，10，30，60，90，150。

以BG－11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，K2HPO4為磷源，為氮源?？刂茽I養(yǎng)鹽初始濃度保持不變，其濃度大到不能成為藻類生長的限制性元素。

1.4 接種［8］與培養(yǎng)

將購買藻種在進行試驗前先增殖培養(yǎng)1周，再饑餓培養(yǎng)3d。

試驗時，將一定量藻種取出，以5 000r／min的速度離心，保留底液，用15mg／L的碳酸氫鈉溶液洗滌后再次離心，依次重復3次，最后用無菌水稀釋后用于接種?？刂破鹗荚迕芏仍?.0×104inds／mL左右。

1.5 培養(yǎng)方法

每天不同初始濃度組有3個重復樣，光照強度控制住3 000lux左右，溫度25±2℃，光暗比14∶10。每天定時取樣檢測藻細胞密度，相對于培養(yǎng)液總體積由于取樣量極少（約0.5mL左右），可以近似認為符合分批培養(yǎng)試驗“試驗過程中無底物和菌體的供應(yīng)和移走”的要求；培養(yǎng)方法符合動力學中的“分批培養(yǎng)試驗”的要求。試驗在無菌操作臺上進行操作。

1.6 細胞生物量的測定

藻細胞生物量的測定采用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)。培養(yǎng)開始后，當鏡檢藻細胞生物量增加小于5%時，可認為藻細胞增殖達到最大現(xiàn)存量，結(jié)束實驗。

1.7 增長率的計算

增長率（μ）指在某一時間間隔內(nèi)藻類生長的速率，計算公式：

式中，x2為某一時間間隔終結(jié)時的藻類現(xiàn)存量；x1為某一時間間隔開始時的藻類現(xiàn)存量，t2－t1為某一時間間隔。

相對于藻類初始接種濃度，初始底物濃度較高，因此在培養(yǎng)開始階段可以檢測到指數(shù)增長期，但由于底物濃度的不同，指數(shù)生長速率及指數(shù)生長期均不相同，根據(jù)底物濃度與生長速率的關(guān)系可應(yīng)用分批培養(yǎng)試驗的動力學模型進行分析。

1.8 動力學參數(shù)的計算

應(yīng)用Leneweaver－Burk作圖法，將Monod方程式μ＝μmaxc／（c＋Ks）變換為以下形式：

式中：μ為微生物的比增殖速度（d－1）；μmax為在飽和濃度中微生物最大比增殖速度（d－1）；c為溶液中限制微生物增殖的底物濃度；Ks為半飽和常數(shù)，其值為μ＝μmax／2時的底物濃度。以最小二乘法求出上述方程的斜率1／μmax和截距Ks／μmax，斜率的倒數(shù)為1／μmax，其與截距的乘積即為半飽和常數(shù)Ks。

2 結(jié)果與分析

2.1 P對小球藻生長的影響

P質(zhì)量濃度對小球藻生長速率的影響見圖1。

圖1 P質(zhì)量濃度對小球藻生長速率的影響

由圖1可以看出，小球藻的生長率與P質(zhì)量濃度關(guān)系符合公式（2）Monod方程，1／μ＝0.004 2 cP＋2.850（R＝0.989 1）。小球藻在無P的條件下幾乎不生長；當P質(zhì)量濃度在0.002mg／L的極低條件下時，小球藻細胞生長受到明顯的抑制；在濃度為0～0.040mg／L的低P條件下比增長率明顯增大，其變化區(qū)間為0.191 7～0.321 0d－1；當P初始質(zhì)量始濃度高于0.200mg／L時，小球藻的生長速率近似維持在同一水平。因此，小球藻細胞對P質(zhì)量濃度反應(yīng)很靈敏，當質(zhì)量濃度達到0.200mg／L時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，在高P質(zhì)量濃度0.400～16.000mg／L范圍內(nèi)，比增長率變化趨勢減緩。根據(jù)P質(zhì)量濃度與增長率的回歸方程，計算得出

2.2 N對小球藻生長的影響

N濃度對小球藻增長率（μ）的影響見圖2。

圖2 N濃度對小球藻增長率（μ）的影響

從圖2可以看出，小球藻的生長率與N質(zhì)量濃度滿足線性關(guān)系，1／μ＝0.515 6 cN＋4.843（R＝0.955 8）。在不同濃度的N培養(yǎng)液中，其質(zhì)量濃度低于0.050mg／L時，小球藻幾乎不生長；N質(zhì)量濃度到達0.800mg／L時，增長率出現(xiàn)了明顯的變化。在N質(zhì)量濃度大于102.40mg／L時，小球藻細胞數(shù)量仍然繼續(xù)增加，但是增長速率明顯變緩，N質(zhì)量濃度不再成為小球藻生長的限制性因子。根據(jù)N質(zhì)量濃度與增長率的回歸方程，計算得出

2.3 N／P對小球藻生長的影響

N／P對小球藻生長的影響見圖3。

由圖3可看出，在0～60的范圍內(nèi)，隨著N／P比值的上升，小球藻的增長率和最大現(xiàn)存量都呈增加趨勢；在N／P比達到60的時候，增長率和最大現(xiàn)存量達到最大值；正常BG－11培養(yǎng)基中N／P＝76／1，兩者對比不難發(fā)現(xiàn)，當N／P＝60時，增長率和最大現(xiàn)存量都約高于N／P＝76／1時的值。本實驗說明當N／P大于60以后，即使N的濃度繼續(xù)增大，對小球藻細胞的增長也不會產(chǎn)生影響。

圖3 N／P對小球藻生長的影響

3 討 論

（1）小球藻細胞生長速率對P質(zhì)量濃度反應(yīng)很靈敏，與0.000mg／L相比，在0.002mg／L的低質(zhì)量濃度下特定增長率就有提高，P質(zhì)量濃度到0.2mg／L時，特定增長率明顯增大；但小球藻在低N質(zhì)量濃度下基本沒有生長，在0.000～0.050mg／L N質(zhì)量濃度范圍內(nèi)特定增長率幾乎沒有變化。

（2）根據(jù)回歸分析求得的最大生長速率μmax為當限制性底物濃度趨向無窮大時生物的生長速率；半飽和常數(shù)Ks值通常是用來衡量生物物種對營養(yǎng)物質(zhì)的親和性，Ks值小，表示親和性好，只要很低的營養(yǎng)物濃度就使種群增殖率達到最大生長率的一半即μmax／2；Ks值大，則親和性差，需要很高的營養(yǎng)物濃度才能使種群增殖率達到μmax／2［9］。小球藻細胞對TP的半飽和常數(shù)KSP＝0.0015，對TN的半飽和常數(shù)KSN＝0.1063，說明CV藻對P的吸收能力遠高于對N的吸收能力。

（3）對小球藻增長率來說，其增加速度較快的TP質(zhì)量濃度區(qū)間：0.000～0.200mg／L，TN質(zhì)量濃度區(qū)間：0.050～0.800mg／L；從現(xiàn)存量看，其增加速度較快的TP質(zhì)量濃度區(qū)間：0.040～0.400mg／L，TN質(zhì)量濃度區(qū)間：0.800～6.400mg／L。

（4）經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，水華的發(fā)生首先是水體中的營養(yǎng)物質(zhì)過量，致使水體達到富營養(yǎng)程度增大，這是發(fā)生水華現(xiàn)象的最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)［10］。但是并非營養(yǎng)物質(zhì)濃度高就一定發(fā)生水華，其中一個重要原因是每種能引起水華的藻類都有其特定的合適營養(yǎng)鹽濃度范圍［11－13］。N／P往往成為藻類生長的重要限制因素，當小球藻在N／P比值為0～60范圍內(nèi)時，隨著N／P比值的上升，小球藻的增長率和最大現(xiàn)存量都呈增加趨勢；在N／P比達到60的時候，增長率和最大現(xiàn)存量達到最大值；正常BG－11培養(yǎng)基中N／P＝76／1，兩者對比不難發(fā)現(xiàn)，當N／P＝60時，增長率和最大現(xiàn)存量都約高于N／P＝76／1時的值，本實驗說明當N／P大于60以后，即使N的濃度繼續(xù)增大，對小球藻細胞的增長也不會產(chǎn)生影響。

［1］ Przytocka J M，Dusazota M，Matusiak K.Intensive culture of Chlorella vulgaris as the second stage of biological purification of nitrogen industry waste water［J］.Water Res，1984，18（1）：1－7.

［2］ 張青田，胡桂坤.硝氮，磷酸鹽，F(xiàn)e3＋，Zn2＋影響小球藻生長的均勻設(shè)計試驗［J］.鹽業(yè)與化工，2006，35（6）：25－27.

［3］ 沈頌東.氮磷比對小球藻吸收作用的影響［J］.淡水漁業(yè)，2003，33（1）：23－25.

［4］ 彭近新.水質(zhì)富營養(yǎng)化與防治［M］.北京：中國環(huán)境科學出版社，1988：1－2.

［5］ Elly Spijkerman.Phosphorus uptake and growth kinetics of two planktonic desmid species［J］.European Journal of Phycology，1996，31：53－60.

［6］ 許 海，楊林章，茅 華，等.銅綠微囊藻、斜生柵藻生長的磷營養(yǎng)動力學特征［J］.生態(tài)環(huán)境，2006，15（5）：921－924.

［7］ 鄭朔方，楊蘇文，金相燦，等.銅綠微囊藻生長的營養(yǎng)動力學［J］.環(huán)境科學，2005，26（2）：152－156.

［8］ 全國富營養(yǎng)化調(diào)查組.湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范［M］.北京：中國環(huán)境科學出版社，1990.

［9］ 崔啟武.生物種群增長的營養(yǎng)動力學［M］.北京：科學出版社，1991.

［10］ 任春平，鐘成華，鄧春光，等.三峽庫區(qū)重慶主城江段營養(yǎng)狀態(tài)變化分析［J］.三峽環(huán)境與生態(tài)，2010，4（187）：14－18.

［11］ 金相燦.中國湖泊富營養(yǎng)化［M］.北京：環(huán)境科學出版社，1990.

［12］ 金相燦.中國湖泊環(huán)境（第1冊）［M］.北京：海洋出版社，1995.

［13］ 劉信安，封 麗，Charles Q.Jia，等.三峽庫區(qū)水華優(yōu)勢藻類生長動力學的普適性研究［J］.環(huán)境科學，2008，8（29）：2143－2148.