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    泛素特異蛋白酶24基因內含子rs12138592 A/G位點多態(tài)性與帕金森病的關系

    2011-01-31 07:36:28林智君陳煜森冼文川陳軍鐘望濤許志恩刑永前趙斌
    中國康復理論與實踐 2011年1期
    關鍵詞:內含子泛素等位基因

    林智君,陳煜森,冼文川,陳軍,鐘望濤,許志恩,刑永前,趙斌

    泛素特異蛋白酶24基因內含子rs12138592 A/G位點多態(tài)性與帕金森病的關系

    林智君,陳煜森,冼文川,陳軍,鐘望濤,許志恩,刑永前,趙斌

    目的探討中國粵西地區(qū)漢族人群泛素特異蛋白酶24(USP24)基因內含子rs12138592 A/G單核苷酸多態(tài)性與帕金森病(PD)的關系。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法測定81例PD患者(病例組)與100名健康成人(對照組)USP24基因內含子rs12138592 A/G位點多態(tài)性。結果病例組GG基因型為77.8%,對照組為62.0%(χ2=5.213,P=0.022)。G等位基因頻率在病例組和對照組分別為88.3%和 79.5%(χ2=4.980,P=0.026)。結論USP24基因內含子rs12138592 A/G位點的G等位基因與GG基因型均可以增加PD的患病風險。

    泛素特異蛋白酶24基因;單核苷酸多態(tài)性;帕金森病

    帕金森病(Parkinson disease,PD)是一種常見于中老年的進行性神經系統(tǒng)變性疾病,以黑質多巴胺能神經元變性缺失和路易小體形成為特征,臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢步態(tài)障礙為主要特征。帕金森病發(fā)病原因迄今不明,但已證明其發(fā)病是多種因素相互作用的結果,遺傳因素在其發(fā)病過程中起著重要作用。泛素特異蛋白酶24(USP24)基因位于人類染色體1p32.3,在心臟、大腦、肺、肝和腎臟呈中度表達[1]。USP24屬于半胱氨酸蛋白酶大家族的一個成員,酶分子含有兩個短而保守的片段即賴氨酸盒和組氨酸盒,序列中具有起催化作用的三聯(lián)殘基,即半胱氨酸、組氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺,能將泛素分子從大的蛋白上移除,發(fā)揮著去泛素化酶的功能[2]。單核苷酸多態(tài)性是一種重要的遺傳標記。近年的研究發(fā)現,USP24多個單核苷酸多態(tài)性位點與帕金森病發(fā)病密切相關[3-5]。本文應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法對USP24基因第9內含子rs12138592 A/G位點多態(tài)性進行檢測,探討USP24基因多態(tài)性與帕金森病發(fā)病的關系。

    1 資料和方法

    1.1 研究對象 病例組81例,均為本院2006年8月~2010年10月在神經內科住院的帕金森病患者,其中男性48例,女性33例;年齡46~87歲,平均(67.05±9.69)歲,所有病例按照2006年中華醫(yī)學會神經病學分會帕金森病及運動障礙學組討論決定的帕金森病診斷標準進行選擇,并排除非帕金森病的診斷。對照組100例,為本院健康體檢者,其中男性62例,女性38例;年齡50~89歲,平均(64.48±8.75)歲,無帕金森病病史。兩組間男女構成比(P=0.707)、平均年齡(P=0.063)均無顯著性差異。病例組和對照組均為粵西地區(qū)漢族人,所有受試者均經知情同意,并經廣東醫(yī)學院醫(yī)學研究倫理委員會同意。

    1.2 研究方法

    1.2.1 基因組DNA的提取 采早晨空腹肘部靜脈血5 ml,3.8%檸檬酸鈉抗凝,用KI法提取外周血白細胞的基因組DNA,在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 PCR擴增USP24基因內含子rs12138592 A/G位點及其側翼序列 利用rs12138592 A/G側翼序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=rs12138592),通過Primer 5.0軟件設計引物。上游引物為 5′-AAC CTC AAT CAG GCA CTC-3′,下游引物為 5′-TGG GCA ACA GAA CAA CTA-3′,引物由上海生工合成。PCR反應體系12.5 μ l,其中包括10×Buffer 1.25 μ l,dNTP(10 mmol/L)1.0 μ l,引物(20 μ mol/L)0.25 μ l,基因組 DNA 1.0 μ l,TaqDNA 聚合酶0.1 μ l,H2O 9.0 μ l。PCR 反應條件:94 ℃預變性5 min(94℃,45 s,52℃退火30 s,72℃延伸40 s)33個循環(huán)后,再于72℃延伸10 min,終止反應。

    1.2.3 酶切反應 利用rs12138592 A/G側翼序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term =rs12138592)在網絡軟件NEBcutter V 2.0(http://tools.neb.com/NEBcutter2)上找到其合適的限制性內切酶HpyCH4Ⅲ,用PCR-RFLP法對病例組和對照組全部樣本的多態(tài)性進行檢測,根據酶切片段條帶的不同分析其基因型和多態(tài)性。取PCR擴增產物0.5 μ l、NEBBuffer 0.5 μ l、HpyCH4 Ⅲ 0.3 μ l、H2O 3.7 μ l,總體系為5 μ l,37 ℃酶切6 h,進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAG)電泳。100 V電泳2 h以后用銀染法染色,觀察結果。

    1.2.4 測序 分別對不同基因型樣本進行雙向測序,測序由上海生工公司完成。

    1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件和遺傳學數理統(tǒng)計方法對所有資料進行統(tǒng)計分析,基因型和等位基因頻率采用直接計數法統(tǒng)計,遺傳平衡性采用Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測,基因型和等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗,計量資料用兩樣本均數t檢驗。顯著性水平α=0.05。

    2 結果

    2.1 多態(tài)性 rs12138592 A/G位點的擴增片段長度為282 bp,HpyCH4Ⅲ酶在此PCR片段中為雙位點內切酶,除了rs12138592 A/G酶切位點外,還有另一固定酶切位點;純合子AA基因型因有1個酶切位點,經HpyCH4Ⅲ酶切后可見235 bp和47 bp 2個片段(47bp片段由于較小顯示不清),純合子GG基因型因有2個酶切位點,酶切后有158 bp、77 bp和47 bp 3個片段,雜合子GA基因型酶切后則有235 bp、158 bp、77 bp和47 bp 4個片段。PCR產物經酶切后結果見圖1。

    為驗證PCR-RFLP方法的可靠性,選取3號標本送上海生工進行測序,測序結果與PCR-RFLP的結果吻合。

    2.2 Hardy-Weinburg吻合度檢驗 病例組與對照組人群的rs12138592 A/G基因型分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinburg平衡,表明兩者的多態(tài)性位點的基因型分布在所研究的人群中已達到了遺傳平衡(病例組χ2=0.02,P>0.05;對照組 χ2=0.54,P>0.05)。

    圖1 rs12138592 A/G位點酶切產物電泳圖

    2.3 基因型頻率和等位基因頻率 病例組基因型頻率分布GG為77.8%(63/81),GA為21%(17/81),AA為1.2%(1/81);而對照組GG為62%(62/100),GA 為 35%(35/100),AA 為3%(3/100),χ2=5.213,P=0.022。病例組G、A等位基因頻率分別為88.3%(143/162)、11.7%(19/162);對照組G 、A 等位基因頻率分別為 79.5%(159/200)、20.5%(41/200),χ2=4.980,P=0.026。

    3 討論

    到目前為止,帕金森病發(fā)病的確切機制尚未完全清楚,普遍認為多個基因和環(huán)境因素以及它們之間復雜的相互作用在帕金森病的發(fā)病過程中起著重要的作用[6]。有關研究已經發(fā)現α-synuclein(PARK1)、Parkin(PARK2)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、LRRK2(PARK8)、ATP13A2(PARK9)等基因突變與家族性帕金森病有關[7]。帕金森病的病理性標志是路易小體,多種異常蛋白的聚集參與路易小體的形成,由泛素介導的蛋白降解途徑的功能受損被認為可能是帕金森病發(fā)病的共同分子機制,這種途徑即是泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)。UPS可選擇性地降解細胞內錯誤折疊蛋白或其他突變蛋白,是一條重要的非溶酶體降解途徑,它在多種與細胞周期性增殖及凋亡相關蛋白的降解中發(fā)揮重要作用[8]。該途徑也是一個被嚴格調控的可逆過程,其中去泛素化酶的調節(jié)就是一個重要的環(huán)節(jié)。

    USP24是一種去泛素化酶,通過裂解切斷泛素鏈與底物蛋白之間的連接及泛素化鏈之間的連接,使單泛素分子從泛素化蛋白底物上或從蛋白酶體降解底物中脫離出來,從而防止多聚泛素在底物蛋白的聚集,使單泛素分子可以重新進入細胞內蛋白調節(jié)的循環(huán)中[9]。USP24的水解作用可以使游離單個泛素分子循環(huán)利用,通過調節(jié)其在細胞內的降解,穩(wěn)定單個泛素分子的水平。USP24突變后,其水解泛素分子間肽鍵的能力下降,影響異常蛋白質的清除,進而引起神經元變性。

    近年來的研究表明,USP24多態(tài)性與帕金森病的遺傳易感性密切相關。Wu等采取病例對照研究,對517例帕金森病患者和518例同一種群的健康人進行USP24 rs487230C/T多態(tài)性與帕金森病發(fā)病風險的相關性研究,發(fā)現在60歲以上的臺灣人群中,USP24 rs487230位點基因型和等位基因頻率在帕金森病患者和對照組之間有顯著性差異(P=0.035),等位基因T和CT/TT基因型能夠減少帕金森病的發(fā)病風險(P=0.020),USP24與帕金森病患病風險呈獨立相關性(P=0.010)[5]。Li等也證實USP24多個與疾病相關的單核苷酸多態(tài)性,其中,rs487230 C/T位點與帕金森病的患病風險顯著相關(P=0.0012)[4]。

    越來越多的研究發(fā)現,內含子可能與基因表達的調控有關,對基因的表達起增強或抑制作用,內含子可以通過影響基因構象,進而影響基因轉錄、翻譯等過程[10];此外,一些基因的內含子突變會引起基因表達效應的變化。在本研究中,帕金森病患者USP24基因內含子rs12138592 A/G位點的G等位基因和GG基因型頻率均高于正常對照組。這表明 rs12138592 A/G的G等位基因和GG基因型與帕金森病密切相關,兩者均可以增加中國粵西地區(qū)漢族人群帕金森病的患病風險。rs12138592 A/G位于USP24基因第9內含子,內含子調節(jié)基因的功能主要通過影響啟動子或增強子區(qū)域轉錄因子結合位點進行轉錄調控[11],或通過剪接增強子或沉默子調節(jié)選擇性剪接[12-13],或通過微小RNA結合位點調節(jié)基因的功能[14-15]。通過網絡軟件FastSNP Search(http://fastsnp.ibms.sinica.edu.tw/)和SNPinfo Web Server(http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/ snpfunc.cgi)對rs12138592 A/G位點多態(tài)性進行分析,未發(fā)現有相關功能。我們推測rs12138592 A/G多態(tài)位點與帕金森病的相關性可能是通過與其他功能性多態(tài)性位點呈連鎖不平衡的作用,從而影響基因表達的調控而導致USP24去泛素化酶活性的改變,最終促進了帕金森病的發(fā)生。

    由于本研究樣本量有限,兩者的相互關系,需要進一步研究,特別是大樣本量的多中心研究來進一步明確。

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    Association of Intron rs12138592 A/G polymorphism of Ubiquitin Specific Proteases(USP24)Gene with Parkinson Disease

    LI N Zhijun,CHEN Yu-sen,XIAN Wen-chuan,et al.Department of Neurology,the A f filiated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,China

    ObjectiveTo investigate the relationship between Parkinson disease(PD)and intron rs12138592 A/G polymorphism of ubiquitin specific proteases(USP24)gene in Han population of the Western Guangdong province in China.Methods81 PD cases and 100 ethnically matched controls were investigated USP24 gene rs12138592 A/G polymorphism with polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).ResultsThe incidence of GG genotype was 77.8%in the cases and 62.0%in the controls(χ2=5.213,P=0.022),and the G allele was 88.3%in the cases,79.5%in the controls(χ2=4.980,P=0.026).ConclusionThe G allele and GG genotype of USP24 gene rs12138592 A/G polymorphism can increase the risk of suffering from PD.

    ubiquitin specific proteases 24 gene;single-nucleotide polymorphism;Parkinson disease

    [本文著錄格式]林智君,陳煜森,冼文川,等.泛素特異蛋白酶24基因內含子rs12138592 A/G位點多態(tài)性與帕金森病的關系[J].中國康復理論與實踐,2011,17(1):56—58.

    廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科,廣東湛江市 524001。作者簡介:林智君(1982-),男,廣東湛江市人,碩士研究生,主要研究方向:腦血管病與神經系統(tǒng)變性疾病。通訊作者:陳煜森。

    R742.3

    A

    1006-9771(2011)01-0056-03

    2010-11-25)

    ·綜述·

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