針康法對(duì)免疫抑制大鼠細(xì)胞免疫功能的影響

朱志中,唐強(qiáng),顏培宇

針康法對(duì)免疫抑制大鼠細(xì)胞免疫功能的影響

朱志中1,唐強(qiáng)2,3,顏培宇3

目的觀(guān)察針康法對(duì)免疫抑制大鼠模型血清白細(xì)胞介素-4(IL-4)及T細(xì)胞亞群的影響。方法將40只健康SD大鼠(雄性)體重200～250 g,完全隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、康復(fù)組、針康組、針刺組,每組8只。除正常組和模型組外,其他各組分別給予針刺或康復(fù)治療,每天1次,治療10 d后,取大鼠血清。用放射免疫法檢測(cè)血清中IL-4含量及外周血CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量。結(jié)果模型組血清IL-4水平升高,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)?？祻?fù)治療和針康法都可降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05);模型組大鼠CD4+T細(xì)胞水平下降,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)針刺和康復(fù)治療后,針刺組和針康組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞水平明顯升高,與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)各組CD8+T細(xì)胞水平于治療前后無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論針康法能降低大鼠血清中IL-4的含量,顯著提高免疫抑制大鼠低下的CD4+T細(xì)胞水平,提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

免疫抑制;針康法;白細(xì)胞介素-4;T細(xì)胞亞群;大鼠

免疫抑制現(xiàn)象存在于多種疾病狀態(tài)中,如病毒感染、惡性腫瘤、不孕不育、腦血管病及艾滋病等。多表現(xiàn)為免疫功能低下、應(yīng)答性淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少、免疫抑制性因子活性增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)以免疫抑制大鼠為模型,探討針康法干預(yù)后免疫抑制大鼠免疫功能變化,為針康法臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠(雄性)40只,體重200～250 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(京)2007-0001)。

1.2 模型制作及分組 取鼠后,飼養(yǎng)環(huán)境控制室溫(22±1)℃,12 h光暗交替(7:00～19:00照明)。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室最初4 d為適應(yīng)環(huán)境期,自由進(jìn)食和飲水,并每天撫摸2～3 min,以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員操作。實(shí)驗(yàn)第5天,各組均腹腔注射新鮮配制的環(huán)磷酰胺注射液50 mg/kg,連續(xù)3 d,第4天加強(qiáng)注射1次,制成免疫抑制模型。采用數(shù)字隨機(jī)法將40只大鼠隨機(jī)分為5組:正常組、模型組、康復(fù)組、針康組、針刺組,每組8只。

1.3 干預(yù)方法

1.3.1 康復(fù)訓(xùn)練 ①滾筒訓(xùn)練:滾筒長(zhǎng)100 cm,直徑60 cm,中間被分為4個(gè)格,可同時(shí)訓(xùn)練4只鼠。底座有固定架,一端有手搖柄,可手搖控制轉(zhuǎn)動(dòng)速度,常規(guī)為10 r/min。將大鼠放入該器內(nèi)可訓(xùn)練大鼠的抓握、旋轉(zhuǎn)、行走等運(yùn)動(dòng),每天1次,每次20 min。②網(wǎng)屏訓(xùn)練:網(wǎng)屏為50×40 cm金屬網(wǎng)帶,網(wǎng)眼為1×1 cm,網(wǎng)板的左右和上方都用25 cm高的木板框邊,網(wǎng)屏距地而高度為80 cm,下方鋪以12 cm厚的海綿。先將網(wǎng)屏水平放置,將老鼠放在其上,然后將其一端抬高,在2 s內(nèi)將此屏變成垂直位,保持5 s訓(xùn)練大鼠的肢體抓握能力,每天1次,每次 20 min。

1.3.2 針刺

1.3.2.1 選穴及定位 選穴:百會(huì)及百會(huì)旁開(kāi)0.5 cm相當(dāng)于于氏頭針的頂區(qū),足三里、關(guān)元(注:針刺組和針康組均選用以上各穴)。取穴定位:參照“十一五”國(guó)家規(guī)劃統(tǒng)編教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》和《腧穴學(xué)》大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖,定位及擬人對(duì)照法定位。膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨小頭下3.5 mm處定位足三里;在劍突和外生殖器連線(xiàn)的上6/7與下1/7交界處定位關(guān)元穴;大鼠頭背部正中縱線(xiàn)與兩耳連線(xiàn)的交點(diǎn)上準(zhǔn)確定位百會(huì)穴。

1.3.2.2 針刺方法及針具 大鼠清醒固定,各穴進(jìn)針3～10 mm,留針30 min。每天 1次,治療 10 d。針具選擇華佗牌30號(hào)1寸針灸針。

正常組、模型組不采用任何干預(yù)措施,康復(fù)組采用康復(fù)訓(xùn)練,針刺組采用針刺治療,針康組先采用針刺治療,然后進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。

1.4 標(biāo)本采集 ①按0.35 ml/100 g大鼠腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后用負(fù)壓采血管心臟取血5 ml左右;②采血后將采血管放入4℃冰箱靜置6 h,取出后3000 r/min,離心20 min;③取盡量多每管中的上清液,放入小試管中。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)及方法 血清白細(xì)胞介素-4(IL-4)的測(cè)定采用酶標(biāo)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法ELISA);大鼠外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量的測(cè)定采用酶標(biāo)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法ELISA)。

每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔做復(fù)孔。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μ l于反映孔內(nèi)、加入待測(cè)樣品血清 50 μ l于反映孔內(nèi)。立即加入50 μ l的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育45 min。甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿(mǎn)洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。每空加入100 μ l的親和鏈霉素-HRP,輕輕震蕩混勻,37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿(mǎn)洗滌液,振蕩30 s,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。每孔加入底物A、B各50 μ l,輕輕震蕩混勻,37℃溫育5 min。避免光照。取出酶標(biāo)板,迅速加入50μ l終止液,立即在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA),方差齊時(shí)選擇 LSD法,方差不齊時(shí)選擇Dunnett T3法。

2 結(jié)果

2.1 不同干預(yù)方法對(duì)血清IL-4含量的影響 與模型組比較,針刺組無(wú)顯著性差異(P＞0.05);與模型組比較,康復(fù)組和針康組有顯著性差異(P＜0.05);康復(fù)組與針康組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清IL-4含量的比較(pg/ml)

2.2 不同干預(yù)方法對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的影響 與正常組比較,模型組大鼠CD4+T細(xì)胞水平及CD8+T細(xì)胞水平明顯下降(P＜0.01);經(jīng)針刺和康復(fù)治療后,針刺組和針康組CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P＜0.01),與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)各組CD8+T細(xì)胞水平于治療前后無(wú)明顯變化(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 大鼠CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的含量(%)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇 目前常用免疫抑制劑制備免疫抑制模型。環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物,具有廣譜抗癌作用,是聯(lián)合化療、手術(shù)和放療輔助化療的常用藥物之一,毒副作用主要是免疫抑制。利用環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型相對(duì)成熟,模型穩(wěn)定。研究表明,環(huán)磷酰胺制備的免疫抑制模型可以降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾臟指數(shù)、抑制淋巴細(xì)胞增殖,降低自然殺傷細(xì)胞活性、抗體生成細(xì)胞功能等。本實(shí)驗(yàn)選擇相對(duì)成熟穩(wěn)定創(chuàng)傷小的造模方法,觀(guān)察針康法對(duì)免疫功能的影響。在劑量選擇上,有報(bào)道用大劑量100 mg/kg或200 mg/kg[1-3]一次性注射制備模型,也有用小劑量多次注射的方法,劑量為20～80 mg/kg不等,注射天數(shù)2～5 d不等[4-9]。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),50 mg/kg注射量安全可靠,天數(shù)在4 d為宜,造模后實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)食欲減退,毛色粗糙,部分大鼠出現(xiàn)血尿及乳糜尿。

3.2針康法對(duì)免疫抑制大鼠血清IL-4含量的影響IL-4曾被命名為B細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1。IL-4主要由活化的CD4+T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,主要作用于B細(xì)胞,促進(jìn)其分化和增殖,表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)分子(MHC-Ⅱ),增強(qiáng)B細(xì)胞的抗原提呈作用,誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生。IL-4還作用于單核/巨噬細(xì)胞,抑制其產(chǎn)生IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子;協(xié)同IL-3刺激肥大細(xì)胞增殖和協(xié)同腦脊液刺激造血細(xì)胞增殖[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組血清IL-4水平升高,與正常組比較有顯著性差異(P＜0.05)。康復(fù)組和針康組都降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平(P＜0.05)。

3.3 針刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)免疫抑制大鼠CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的影響 CD4+T細(xì)胞是不均一的細(xì)胞群,根據(jù)所分泌細(xì)胞因子的不同將CD4+T細(xì)胞分為T(mén)h1和Th2細(xì)胞。目前已分別在小鼠和人類(lèi)建立Th1和Th2細(xì)胞克隆。Thl細(xì)胞主要介導(dǎo)與細(xì)胞毒和局部炎癥有關(guān)的免疫應(yīng)答,參與細(xì)胞免疫及遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥的形成,故也稱(chēng)之為炎性T細(xì)胞,可認(rèn)為相當(dāng)于遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞(TDTH細(xì)胞)。因而Th1細(xì)胞在抗細(xì)胞內(nèi)病原體(包括病毒、細(xì)菌及寄生蟲(chóng)等)感染中發(fā)揮重要作用。Th2細(xì)胞的主要功能是刺激B細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體,與體液免疫相關(guān)。CD8+T細(xì)胞又稱(chēng)細(xì)胞毒性 T細(xì)胞(CT L),參與抗病毒免疫、抗腫瘤免疫以及對(duì)移植物的排斥反應(yīng)。CT L的主要?dú)麢C(jī)制為:①分泌穿孔素和顆粒酶,引起細(xì)胞溶解;②活化的CTL表達(dá)FasL,通過(guò)與靶細(xì)胞表面的Fas抗原結(jié)合,誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。

T細(xì)胞亞群的數(shù)量及活性是細(xì)胞免疫功能的直接反映。實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠與正常組比較CD4+T細(xì)胞水平明顯下降,提示造模后大鼠的細(xì)胞免疫功能受到抑制;與模型組比較,經(jīng)針刺和康復(fù)治療后,針刺組和針康組CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P＜0.01)。說(shuō)明針刺和康復(fù)訓(xùn)練能夠顯著提高免疫抑制大鼠的細(xì)胞免疫功能,具有增強(qiáng)免疫的作用。

本研究結(jié)果表明,單純康復(fù)訓(xùn)練可以降低模型組大鼠血清IL-4的含量,單純針刺治療亦可提高模型組大鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)量,而針康法的優(yōu)勢(shì)在于在降低模型組大鼠血清IL-4的含量同時(shí)亦可提高模型組大鼠CD4+T細(xì)胞數(shù)量而取得較好的治療效果。

[1]羅秋平,譚禮智,王慧.卡介菌多糖核酸和死卡介菌對(duì)環(huán)磷酰胺免疫抑制作用的影響[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,21(4):281-284.

[2]雷志明,于芳,鄒梅,等.環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1989,3(2):108-109.

[3]馮景奇,柳鐘勛.當(dāng)歸內(nèi)酯拮抗環(huán)孢菌素A、氫化可的松及抗腫瘤藥物的免疫抑制作用[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2000,(1):22-24.

[4]代卉,樂(lè)國(guó)偉,孫進(jìn),等.小麥肽對(duì)受環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化功能[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,(4):549-553.

[5]高芃,錢(qián)嘉林,劉長(zhǎng)喜,等.環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫抑制的動(dòng)物模型建立[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2004,(4):314-317.

[6]呂建新,金麗琴.細(xì)腳擬青霉對(duì)小鼠體液免疫功能的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志,1996,8(6):8-10.

[7]郭國(guó)華,魯耀邦,蔣茂恒,等.人參五靈脂水煎液配伍對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響[J].中草藥,1994,25(5):253-255.

[8]關(guān)寧,霍桂枝,於傳斌,等.金藍(lán)寶對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)海洋藥物雜志,1996,2:7-11.

[9]韓春楊,劉翠艷.中藥免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)免疫抑制模型小鼠的保護(hù)作用[J].J Northwest A F University(Natural Science E-dition),2010,38(2):47-51.

[10]唐恩潔.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].成都:四川大學(xué)出版社,2004.

Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Cellular Immunity of Immunosuppressive Rats

Z HU Zhi-zhong,TANGQiang,Y AN Pei-yu.Tianjin Huanhu Hospital,Tianjin 300060,China

ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on interleukin-4(IL-4),T lymphocyte subsets of immunosuppressive model rat.Methods40 healthy SD rats(male,200～250 g)was divided into 5 groups randomly:normal group(NG),model group(MG),acupuncture group(AG),rehabilitation group(RG),and acupuncture with rehabilitation group(ARG),8 rats in each group.Each group was treated by acupuncture or rehabilitation except the model or normal group,once a day for 10 d.Radioimmunoassay and malondialdehydein(MDA)technique were used to test the contents of IL-4 and T lymphocyte subsets in each group.ResultsThe contents of IL-4 of immunosuppressive rats can decrease significantly in RG and ARG(P＜0.05).The level of CD4+T lymphocyte increased more significantly in AG and RAG than in MG after the treatment(P＜0.01).ConclusionTang's Approach can decrease the contents of IL-4 and improve the level of CD4+T lymphocyte in rats.

immunosuppression;Tang's Approach;interleukin-4;T lymphocyte subsets;rat

[本文著錄格式]朱志中,唐強(qiáng),顏培宇.針康法對(duì)免疫抑制大鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):313—315.

1.教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金(20092327110002);2.黑龍江省研究生創(chuàng)新科研資金項(xiàng)目(YJSCX2009-163HLJ)。

1.天津市環(huán)湖醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,天津市 300060;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱市150001;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱市 150004。作者簡(jiǎn)介:朱志中(1983-),男,黑龍江雙鴨山市人,碩士研究生,醫(yī)師,主要研究方向:神經(jīng)疾病的綜合康復(fù)治療。通訊作者:唐強(qiáng)(1963-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)方法研究。

R245,R49

A

1006-9771(2011)04-0313-03

2011-03-16)

·專(zhuān)題·