針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1αmRNA的影響

趙振峰,王芳,劉宏光,李洪梅,唐強(qiáng)

針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1αmRNA的影響

趙振峰1,2,王芳2,劉宏光2,李洪梅2,唐強(qiáng)2

目的探討針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)mRNA的影響。方法將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組組(n=6)、模型組(n=18)、針康組(n=18)和康復(fù)組(n=18)。采用光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性腦缺血模型,將模型組、針康組和康復(fù)組再分為3 d、7 d、14 d 3個(gè)亞組。術(shù)后24 h對(duì)針康組進(jìn)行頭穴叢刺結(jié)合水迷宮訓(xùn)練干預(yù),康復(fù)組僅進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,模型組不給予任何干預(yù)。采用Y-型迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,反轉(zhuǎn)PCR(RT-PCR)法觀察各組大鼠海馬組織中SDF-1αmRNA表達(dá)情況。結(jié)果術(shù)后各時(shí)間點(diǎn),正常對(duì)照組、針康組、針康組大鼠學(xué)習(xí)能力優(yōu)于模型組(P＜0.05),與康復(fù)組比較,針康組術(shù)后3 d無顯著性差異(P＞0.05);術(shù)后7 d、14 d有顯著性差異(P＜0.05);與正常對(duì)照組比較,模型組、針康組和康復(fù)組均有顯著性差異(P＜0.05);與模型組比較,針康組、康復(fù)組SDF-1 mRNA均有顯著性差異(P＜0.05);與康復(fù)組相比,針康組SDF-1 mRNA表達(dá)較高,術(shù)后3 d、7 d顯著性差異(P＜0.05),14 d無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論針康法能上調(diào)局灶性腦缺血大鼠海馬SDF-1αmRNA,這可能是其促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的提高機(jī)制之一。

腦缺血;針康法;學(xué)習(xí)記憶;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1αmRNA;大鼠

腦缺血區(qū)血管再生的程度和范圍直接影響組織血液供應(yīng)。通過對(duì)腦缺血后腦外成血管因素的調(diào)動(dòng),能夠促進(jìn)腦缺血區(qū)血管再生以治療腦缺血[1],提示加強(qiáng)動(dòng)員內(nèi)源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)可能成為臨床治療腦缺血的一種有效方法。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)/CXCR4軸對(duì)EPC具有動(dòng)員、增殖并誘導(dǎo)其歸巢至缺血組織區(qū)的作用[2]。本實(shí)驗(yàn)探討針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬CA1區(qū)SDF-1αmRNA表達(dá)的影響,旨在闡明針康法的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠,體重200～250 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(京)2009-0001)。將60只大鼠隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組(n=6)、模型組(n=18)、針康組(n=18)和康復(fù)組(n=18)。采用光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性腦缺血模型,將針康組、康復(fù)組和模型組再分為 3、7、14 d 3個(gè)亞組,每組6只。

1.2 主要試劑 ①虎紅(四氯四碘熒光素納)粉劑:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):F20091021;②Real Time PCR:HaiGene,SYBR Green熒光定量試劑盒,由上海西唐生物科技有限公司提供;③水合氯醛:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20080319;④Trizol:Invitrogen Corp.,USA;⑤cDNA第一鏈合成試劑盒:HaiGene Corp.,China,引物由上海生工公司合成。

1.3 主要儀器 ①冷光源由哈爾濱工業(yè)大學(xué)研制,激光為發(fā)光光源,濾去全部紫外線與紅外線,投射出單一綠光束,波長(zhǎng)為(530±30)nm;②Morris水迷宮:華北正華生物儀器設(shè)備有限公司;③熒光定量 PCR儀ABl7500:ABI Corp.,USA。

1.4 模型制備 采用光化學(xué)誘導(dǎo)法[3]:大鼠用10%水合氯醛按35 mg/kg常規(guī)麻醉后,將其俯臥于腦立體定位儀上,沿頭顱正中切開頭皮暴露顱骨,在前囟后3.5 mm、中線向左旁開2 mm處,用牙科鉆輕輕鉆一個(gè)直徑約1 mm的骨窗,光纖管尾端至硬膜下3.5 mm?；⒓t按70 mg/kg于腹腔注射,注射時(shí)間1.5 min。5 min后通過光纖管照射局部海馬組織。照射時(shí)間:5 min。術(shù)后縫合頭皮,正常喂養(yǎng)。1.5干預(yù)方法

1.5.1 針康組 術(shù)后24 h進(jìn)行針康法干預(yù),按“大鼠穴位圖譜”所示,取百會(huì)穴及百會(huì)左、右側(cè)各旁開2 mm處針刺(應(yīng)用頭穴叢刺針法),快速捻轉(zhuǎn)1 min后留針2 h,在留針期間進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練,每天1次。

Morris水迷宮訓(xùn)練:從站臺(tái)所占象限外的另三個(gè)象限隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn),將大鼠面向池壁放入池中,觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的潛伏期。如2 min內(nèi)找不到站臺(tái),則將其在站臺(tái)上放置30 s后再放回籠中,此時(shí)潛伏期記為120 s。訓(xùn)練時(shí)分別從3個(gè)不同的入水點(diǎn)入水,每次不同動(dòng)物的入水點(diǎn)相同,訓(xùn)練順序固定。

1.5.2 康復(fù)組 術(shù)后24 h僅給予水迷宮訓(xùn)練,方法同上。

1.5.3 模型組 術(shù)后不進(jìn)行任何處理,自然恢復(fù)。

1.5.4 正常對(duì)照組 不進(jìn)行任何處理。

1.6 學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)估 Y-型迷宮為一個(gè)三等臂式迷宮,每臂頂端設(shè)一信號(hào)燈,信號(hào)燈亮后6 s,此臂即為危險(xiǎn)區(qū),通以36 V交流電,刺激大鼠從所在的亮臂跑到暗臂。訓(xùn)練中始終有一臂為安全區(qū),安全區(qū)按無規(guī)則的次序變換。如果大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯(cuò)誤,跑到暗臂則為正確。1 d內(nèi)連續(xù)分段訓(xùn)練大鼠,每10次為1段,兩段間大鼠休息2 min。記錄大鼠掌握迷宮結(jié)構(gòu)(續(xù)10次測(cè)試中有9次正確即為掌握迷宮結(jié)構(gòu))所需的訓(xùn)練次數(shù),訓(xùn)練次數(shù)越少,表明大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。以此作為判斷大鼠學(xué)習(xí)分辨能力的指標(biāo)。

1.7 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)檢測(cè)完畢,斷頭取

腦組織,生理鹽水沖洗,取海馬迅速投入-80℃液氮中保存?zhèn)溆谩?注:正常對(duì)照組于第3天斷頭)

1.7.1 總RNA提取 組織于液氮條件下研磨粉碎,取100 mg裝入1.5 ml EP管中;向每管中加入Trizol試劑1 ml;用移液槍反復(fù)吹吸,直至裂解液中無明顯沉淀,室溫靜置 5 min;向上述裂解液中加入 200 μ l氯仿,蓋緊離心管蓋,用力震蕩15 s,待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后,室溫靜置5 min;12000 g 4℃離心15 min;從離心機(jī)中小心取出離心管,此時(shí)勻漿液分為3層,即:無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;向上清液中加入等體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后20℃室溫靜置10 min;12000×g 4℃離心10 min;小心棄去上清,緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿觸及沉淀),輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁。2℃～8℃12 000 g離心5 min,棄上清;室溫干燥沉淀 5 min,加入 100 μ l無 RNase的水,55℃～60℃放置10 min完成RNA提取。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè) RNA的完整性,紫外線分光光度計(jì)測(cè)定A260和 A280的 OD值,求出A260/A280的比值,要求比值在1.8～2.0之間。

1.7.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在PCR管中配制混合液,在PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng):65℃5 min,然后置于冰上急冷。在PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.7.3 Real Time PCR引物 參照PubMed基因庫提供序列,SDF-1αmRNA序號(hào)NM-022177.3,設(shè)計(jì)出引物,并由上海生工公司合成。SDF-1α mRNA(123bp)引物上游序列5'-GCATCAGTGACGGTAAGC-3',下游引物序列 5'-GAAGGGCACAGTT TGGAG-3'。

1.7.4 SDF-1αmRNA水平分析 用 Quantity One 4.40版軟件分析產(chǎn)物條帶,SDF-1αmRNA與內(nèi)參βactin的累積光密度值比值即為其mRNA相對(duì)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)估 Y-迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示,術(shù)后各時(shí)間點(diǎn),正常對(duì)照組、針康組、針康組大鼠學(xué)習(xí)能力優(yōu)于模型組(P＜0.05),與康復(fù)組比較,針康組術(shù)后3 d無顯著性差異(P＞0.05),術(shù)后7 d、14 d有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR檢測(cè)海馬SDF-1 mRNA的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較,模型組、針康組和康復(fù)組均有顯著性差異(P＜0.05);與模型組比較,針康組、康復(fù)組均有顯著性差異(P＜0.05);與康復(fù)組相比,針康組 SDF-1 mRNA表達(dá)較高,術(shù)后 3 d、7 d顯著性差異(P＜0.05),14 d無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)學(xué)習(xí)記憶能力比較(次)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)SDF-1 mRNA檢測(cè)結(jié)果(相對(duì)值)

3 討論

許多研究表明,成年動(dòng)物(包括人)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在具有自我更新和多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞。正常情況下,它們處于靜息狀態(tài),只有在一定的信號(hào)刺激下才能被激活。腦缺血時(shí),大腦皮層、海馬、腦室下區(qū)等區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞能夠增殖、遷移和分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞[4-5],而且新生神經(jīng)元能夠部分替代受損的神經(jīng)元及其功能。腦缺血后給予頭穴叢刺[6]和康復(fù)訓(xùn)練能夠促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的激活,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的自身修復(fù)能力增強(qiáng),從而促進(jìn)機(jī)體的康復(fù)[7]。

SDF-1α是CXC趨化因子家族成員之一,是為數(shù)不多的表達(dá)于腦組織中的趨化因子之一。在正常神經(jīng)系統(tǒng)中,SDF-1α量維持在較低水平,不發(fā)揮遷移趨化作用。有研究表明,以SDF-1為代表的趨化因子可能在神經(jīng)干細(xì)胞的定向遷移過程中發(fā)揮著重要作用[8]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生缺血和缺氧等病變后,可引起SDF-1α水平的上調(diào),趨化血液系統(tǒng)中的單核、巨噬細(xì)胞向損傷區(qū)遷移并發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)在體內(nèi),SDF-1α廣泛表達(dá)在各種器官和組織中。當(dāng)SDF-1α與其特異性受體CXCR4結(jié)合后,與CXCR4相連的G蛋白被激活,并進(jìn)一步激活下游的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,從而使細(xì)胞骨架發(fā)生改變,引起細(xì)胞遷移、黏附,并調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和分化。此過程在體外已被證實(shí)[9]。Robin[10]發(fā)現(xiàn)缺血半暗帶區(qū)域的SDF-1α水平升高,水平升高的SDF-1α?xí)鳛橐环N趨化因子吸引內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞移行到受損的部位,并黏附歸巢于此處。

本實(shí)驗(yàn)以光化學(xué)法誘導(dǎo)局灶性腦缺血模型,研究針康法對(duì)SDF-1αmRNA的表達(dá)影響。結(jié)果顯示,腦缺血后,缺血區(qū)腦組織釋放出大量SDF-1α,第3天表達(dá)開始增加。針康組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SDF-1αmRNA的表達(dá)較模型組高(P＜0.05)。提示針康法可促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠海馬SDF-1αmRNA的表達(dá)。以往研究也表明,電針能通過上調(diào)局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)大腦皮質(zhì)SDF-1αmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)而促進(jìn)缺血區(qū)大腦皮質(zhì)血管再生[11]。

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),局灶性腦缺血大鼠進(jìn)行針康法、康復(fù)組干預(yù)后,Y-迷宮試驗(yàn)評(píng)定學(xué)習(xí)記憶能力較模型組明顯改善,與海馬SDF-1αmRNA表達(dá)增加相一致,但針康組優(yōu)于康復(fù)組。提示針康法促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)、記憶的改善,可能與海馬SDF-1αmRNA表達(dá)增加有關(guān)。

對(duì)腦缺血大鼠針康法干預(yù)后海馬SDF-1αmRNA表達(dá)變化的研究將有助于從分子水平闡明神經(jīng)可塑性機(jī)制,為尋找有效的治療方法提供新的思路,對(duì)于深入地了解中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力具有重要的意義,并為腦缺血的臨床康復(fù)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

[1]趙旺,羅勇.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與腦缺血的相互關(guān)系[J].中國腦血管病雜志,2009,6:272-276.

[2]張珊珊,羅勇.SDF-1/CXCR4軸在內(nèi)皮祖細(xì)胞治療腦缺血中的作用[J].國際腦血管病雜志,2009,17(10):792-796.

[3]潘惠娟,李玲,劉衛(wèi),等.光化學(xué)法誘導(dǎo)大鼠雙側(cè)海馬梗死模型的建立[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2005,27(11):645-648.

[4]Kokaia Z,Lindvall O.Neurogenesis after ischaemic brain insults[J].Curr Opin Neurobiol,2003,13:127-132.

[5]Tureyen K,Vemuganti R,Sailor KA,et al.Transient focal cerebral ischemia-induced neurogenesis in the dentate gyms of the adult mouse[J].J Neurosurg,2004,101:799-805.

[6]唐強(qiáng),白晶,王艷,等.頭穴叢刺法調(diào)控大鼠腦梗死后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖遷移分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(8):676-679.

[7]楊永軒,郭宗成,賈子善.神經(jīng)干細(xì)胞與腦梗死康復(fù)[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2007,12(13):1137-1140.

[8]Dey JH,Bianchi F,Voshol J,et al.Targeting fibroblast growth factor receptors blocks P13K/AKT signaling,induces apoptosis,and impairs mammary tumor outgrowth and metastasis[J].Cancer Res,2010,70(10):415l-4162.

[9]陳二濤,馮東福,潘棟超,等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的趨化作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2010,27(6):774-776.

[10]Robin AM,Zhang ZG,Wang L,et al.Stromal cell-derived factor 1 alpha mediates neural progenitor cell motility after focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26:125-134.

[11]趙旺,羅勇.電針對(duì)局灶腦缺血再灌注大鼠大腦皮質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α表達(dá)的影響及其促進(jìn)腦內(nèi)血管再生的作用[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2010,32(6):409-413.

Effect of Cluster Needling of Scalp Acupuncture Combined with Rehabilitation on Learning and Memoryand HippocampusStromal Cell-derived Factor-1αmRNA in Rats after Focal Cerebral Ischemia

ZHAO Zhen-feng,WANG Fang,LIU Hong-guang,et al.Department of Rehabilitation Medicine,the 5nd Hospital af filiated to Harbin Medical University,Harbin 163000,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the effect of cluster needling of scalp acupuncture combined with rehabilitation(Tang's Approach)on learning and memory and hippocampus SDF-1αmRNA in rats after focal cerebralischemia.Methods60 rats was randomly divided into 4 groups:the controlgroup(n=6),the model group(n=18),the acupuncture with rehabilitation group(n=18)and rehabilitation group(n=18).Photochemical activity was adopted to induce focal cerebral ischemia model.The acupuncture with rehabilitation group,the model group and rehabilitation group was divided into 3 subgroups by 3,7,14 days.24 hours after molded,the cluster needle of scalp point with Water maze training was used in the acupuncture with rehabilitation group,Water maze training was used in the rehabilitation group,but the model group did not intervene.The learning and memory in rats was evaluated by Y-maze,and the expression of hippocampus SDF-1αmRNA was observed by RT-PCR method on 3th,7th,14th day after infarction.ResultsOn 3th,7th,14th day after infarction,the scores of learning and memory in other groups was less than the control group(P＜0.05),but the learning and memory in the acupuncture with rehabilitation group had been restored,and the difference was statistically significant compared with rehabilitation group(P＜0.05)on 7th,14th day after infarction;the expression of hippocampus SDF-1αmRNA has been risen in the acupuncture with rehabilitation group compared with the rehabilitation group(P＜0.05),but the difference was not significant on 14th day after surgery(P＞0.05).ConclusionThe hippocampus SDF-1αmRNA after focal cerebral ischemia increases by the cluster needle of scalp point with Water maze training,which may be one of the mechanisms to improve the learning and memory by Tang's Approach after focal cerebral ischemia.

cerebral ischemia;Tang's Approach;learning and memory;stromal cell-derived factor-1αmRNA;rats

[本文著錄格式]趙振峰,王芳,劉宏光,等.針康法對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1αmRNA的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):307—309.

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,黑龍江大慶市 163000;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱市 150040。作者簡(jiǎn)介:趙振峰(1965-),男,黑龍江明水縣人,博士研究生,教授,主任醫(yī)師,主要研究方向:神經(jīng)康復(fù)。通訊作者:唐強(qiáng)(1963-),教授,博士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)方法研究。

R245,R49,R743.3

A

1006-9771(2011)04-0307-03

2011-03-16)

·專題·