柱切換LC-MS/MS分析吸毒尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?/h1>
2011-01-30 02:15:48葉海英張玉榮陳永生
質(zhì)譜學報 2011年3期
梁 晨,葉海英,張玉榮,汪 蓉,陳永生
(上海市公安局刑事科學技術(shù)研究管理中心,上海市現(xiàn)場物證重點實驗室,上海 200083)
近年來,隨著國際毒潮持續(xù)泛濫,境外毒品對我國的侵襲日益加劇,吸食或注射海洛因的人員也越來越多。為了打擊毒犯、維護正義,禁毒部門逐年加大對毒品案件的偵查力度。禁毒部門在偵破毒品案件時,常與吸毒嫌疑人員打交道,由于“單抗免疫檢測試劑盒”容易受到某些藥物的干擾出現(xiàn)假陽性,不能直接單獨用于吸毒案件的定性依據(jù),因此定性檢驗這類人群體液中的毒品來判斷他們是否吸食毒品海洛因就尤為重要。海洛因進入人體后,很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡,幾乎檢測不到原體海洛因,而嗎啡屬于水溶性藥物,極性較大,應用氣相色譜直接分析較為困難,而且靈敏度低。目前,已有很多 GC/MS法分析尿樣中嗎啡的報道,但檢材必須采用混合溶劑(V(氯仿)∶V(異丙醇)=9∶1的溶劑)提取、丙酸酐衍生化后用 GC/MS定性分析,樣品處理繁瑣,難以滿足實際案件快速檢驗的需要[1-3]。
樣品前處理是生物樣品分析的重要步驟,也是費時、工作量大的過程。柱切換技術(shù)通過閥切換將處理試樣與分析統(tǒng)一在一個系統(tǒng)中,不僅增加了處理樣品的安全性,而且減少了人為因素的影響,提高了方法的準確度和精密度[4-5]。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)集液相色譜高效的在線分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體,已成為法醫(yī)毒物分析強有力的工具。多反應監(jiān)測(MRM)模式通過兩次離子選擇作用,鎖定目標物的母離子-子離子對,提高了分析的專一性和靈敏度[6]。本工作通過儀器改裝,將柱切換技術(shù)與LC/MS聯(lián)用,尿樣直接進樣分析嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙?？纱?。
要實現(xiàn)柱切換,儀器至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥。實驗室在購買了整套的Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀后,為了實現(xiàn)在線前處理(即柱切換功能),又增配了1臺 Waters 1525高壓二元泵和1個十通切換閥。通過內(nèi)部流路的重新連接和改裝,用Alliance 2695的進樣器實現(xiàn)大體積進樣,1525高壓二元泵輸送預處理流動相,樣品在預處理柱上被凈化和富集,沖洗一定時間(即預處理時間)后,通過十通切換閥,使分析流動相進入預處理柱,把被測組分沖入Alliance 2695的流路中,經(jīng)過一定時間(即切換時間)后,十通切換閥又切換成原狀,Alliance 2695繼續(xù)輸送分析流動相進行色譜柱分離,并最終進入到Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中進行檢測,預處理柱則平衡準備下一次進樣。切換過程示于圖1。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀:美國 Waters公司產(chǎn)品,配有 Waters 1525高壓二元泵,Mass Lynx V4.1軟件,十通切換閥。
對照品:由中國藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標嗎啡-d3:美國Cerilliant公司產(chǎn)品。
乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨(色譜純):購自德國Merck公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;水為自制超純水。
儲備液:固體對照品配成1.0 g/L甲醇溶液,再按照濃度配成混合稀釋液。內(nèi)標配成濃度為0.1 g/L甲醇溶液。
1.2 儀器條件
1.2.1 液相色譜條件 1)預處理柱型號:Oasis?HLB 2.1 mm×20 mm×25μm;預處理柱柱溫:室溫;預處理流動相:水;流速:1.0 mL/min;切換時間:0.60～3.00 min。2)分析柱型號:Xterra?MS C182.1 mm×150 mm×3.5 μm;分析柱柱溫:35 ℃;分析流動相 A:2 mmol/L甲酸銨和 0.05%甲酸的水溶液(0.126 g甲酸銨和 500μL甲酸,加水至 1 000 mL);分析流動相B:2 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈(0.126 g甲酸銨和500μL甲酸溶于40 mL水中,加入960 mL乙腈);流速:0.2 mL/min;梯度洗脫:0 min 90%A 10%B,5 min 90%A 10%B;7 min 40%A 60%B,12 min 40%A 60%B,12.05 min 90%A 10%B;進樣量:100μL。
圖1 柱切換過程示意圖Fig.1 Schematic representation of the column-switching set-up
1.2.2 質(zhì)譜條件 多反應監(jiān)測(MRM)模式,正離子掃描,電噴霧電壓3 200 V,霧化氣(N2)流速600 L/h,錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h,離子源溫度105℃,碰撞氣為氬氣。
1.2.3 MRM參數(shù) 每個化合物設(shè)2對母離子-子離子對,各參數(shù)列于表1。
表1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標的質(zhì)譜MRM參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters and diagnostic ions for morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2 結(jié)果
2.1 色譜圖
嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標在選定的液相色譜分析條件下,保留時間分別為 6.01、7.69、9.58、10.80、6.01 min,色譜行為良好,總離子流色譜圖示于圖2。
2.2 檢測限
當信噪比(S/N)為3時,各化合物的檢測限列于表2。
圖2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2.3 線性關(guān)系和精密度
分別取不同量的對照品混合液于具塞尖底試管中,吹干后加入空白尿樣配成系列濃度的樣品。以峰面積與內(nèi)標峰面積之比(y)對樣品中化合物的濃度(x)作圖,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),各化合物的線性關(guān)系良好(表2)。高、中、低濃度日內(nèi)重復測定6次得日內(nèi)精密度,連續(xù)測定4天得日間精密度,列于表3。
2.4 案例應用
本方法已經(jīng)應用于多起實際案件的吸毒尿樣分析,其中一例吸毒致死案件的尿樣檢材中檢出嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虺煞?色譜圖示于圖3。
表2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因的檢測限和線性關(guān)系Table 2 The limit of detection,linear equation and coefficient of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,and acetylcodeine
表3 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻娜諆?nèi)及日間精密度Table 3 Intra-and inter-day precision of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine and acetylcodeine
圖3 一例吸毒致死案件的尿樣色譜圖Fig.3 Chromatogram of a case
3 討論
在線固相萃取(SPE)的主要優(yōu)點有:1)前處理簡單,自動化操作,樣品只需簡單處理或不經(jīng)處理即可進樣分析,因此也適用于不穩(wěn)定藥物的分析;2)富集被測組分,提高了分析靈敏度,尤其是水溶性較大的組分,無法用液-液萃取時,HPLC柱切換技術(shù)則很有效;3)由于進樣體積較大,處理樣品的全過程由儀器程序控制,可獲得很高的精密度與重現(xiàn)性。
采用柱切換方法,切換時間的確定至關(guān)重要。通過實驗確定預處理流動相的沖洗時間,初始為狀態(tài)1,預處理柱和分析柱是并聯(lián)狀態(tài),進樣后各化合物富集、保留在預處理柱上,0.60 min后切換到狀態(tài)2,既可除去尿液中的水溶性雜質(zhì)和鹽類,又使峰面積達到最大化,時間增加或者減少峰面積均減小。在狀態(tài)2時,預處理柱和分析柱串聯(lián)在一起,分析流動相將保留在預處理柱上的化合物洗脫進入分析柱,3.00 min后回到狀態(tài)1,化合物繼續(xù)在分析柱上完成分離,時間增加峰面積不再增加,僅保留時間延長,因此確定切換時間為0.60～3.00 min。
液相色譜分析條件的確定:以乙腈和水作為流動相主體,由于樣品離子化的需要,在水中需要加入甲酸和甲酸銨,其中甲酸主要起到改善峰形的作用,甲酸銨可以提高儀器信號的響應值。由于梯度洗脫會影響色譜峰面積的穩(wěn)定性,通過在乙腈中加入相同濃度的甲酸和甲酸銨,保證梯度變化過程中甲酸和甲酸銨的濃度一致,改善了色譜峰面積的穩(wěn)定性。嗎啡類生物堿水溶性較大,在色譜柱上不易保留,由于母體結(jié)構(gòu)相似,碎片離子也相同,為了方法定性定量的準確性,避免相互干擾,有必要使分析的化合物能在保留時間上分開,于是采用了初始為10%水相的梯度洗脫,各化合物得到良好的分離。
[1]何國標,蔣碩勤,羅正堅.嗎啡類毒品的固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定[J].分析測試學報,2008,27(增刊):11-12.
[2]朱彬玲.尿中O6-乙酰嗎啡的膜式固相萃取及 GC/MS/SIM測定[J].漳州師范學院學報,2007,20(2):88-91.
[3]呂海茹.尿中嗎啡常見檢測方法[J].刑事技術(shù),2008,2:29-31.
[4]梁 晨,郭幼梅,金琦蕓,等.柱切換高效液相色譜法測定尿中苯駢二氮雜卓類藥物[J].中國臨床藥學雜志,2003,12(3):157-160.
[5]JAGERDEO E,MONTGOMERY M A,L EBEAU M A,et al.An automated SPE/LC/MS/MS method for the analysis of cocaine and metabolites in whole blood[J].Journal of Chromatography B,2008,874(1/2):15-20.
[6]向 平,沈 敏,沈保華,等.生物檢材中嗎啡類生物堿的LC-MS/MS分析[J].法醫(yī)學雜志,2006,22(1):52-57.
猜你喜歡
尿檢時如何取中段尿家庭科學·新健康(2022年2期)2022-03-07 06:13:38 勘誤：介入放射學雜志(2022年11期)2022-03-04 04:02:41 褪黑素和嗎啡聯(lián)合使用能提高嗎啡鎮(zhèn)痛效果醫(yī)藥前沿(2020年23期)2020-12-03 04:08:05 跟蹤導練（3）時代英語·高一(2018年5期)2018-11-19 10:55:06 跟蹤導練（三）2時代英語·高一(2017年5期)2017-11-14 15:52:20 含可待因藥品：兩類人禁用大眾醫(yī)學(2017年3期)2017-03-21 19:42:40 31人奧運尿樣未過關(guān)環(huán)球時報(2016-05-18)2016-05-18 08:49:41 懸浮固化液相微萃取-高效液相色譜法測定人血漿和尿樣中的卡巴咪嗪色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:30 江浙滬樣本兒童過半晨尿檢出抗生素濫用抗生素傷不起中國環(huán)境科學(2015年7期)2015-01-28 11:41:53 μ阿片受體在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中的研究進展西南軍醫(yī)(2015年2期)2015-01-22 09:09:44
梁 晨,葉海英,張玉榮,汪 蓉,陳永生
(上海市公安局刑事科學技術(shù)研究管理中心,上海市現(xiàn)場物證重點實驗室,上海 200083)
近年來,隨著國際毒潮持續(xù)泛濫,境外毒品對我國的侵襲日益加劇,吸食或注射海洛因的人員也越來越多。為了打擊毒犯、維護正義,禁毒部門逐年加大對毒品案件的偵查力度。禁毒部門在偵破毒品案件時,常與吸毒嫌疑人員打交道,由于“單抗免疫檢測試劑盒”容易受到某些藥物的干擾出現(xiàn)假陽性,不能直接單獨用于吸毒案件的定性依據(jù),因此定性檢驗這類人群體液中的毒品來判斷他們是否吸食毒品海洛因就尤為重要。海洛因進入人體后,很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡,幾乎檢測不到原體海洛因,而嗎啡屬于水溶性藥物,極性較大,應用氣相色譜直接分析較為困難,而且靈敏度低。目前,已有很多 GC/MS法分析尿樣中嗎啡的報道,但檢材必須采用混合溶劑(V(氯仿)∶V(異丙醇)=9∶1的溶劑)提取、丙酸酐衍生化后用 GC/MS定性分析,樣品處理繁瑣,難以滿足實際案件快速檢驗的需要[1-3]。
樣品前處理是生物樣品分析的重要步驟,也是費時、工作量大的過程。柱切換技術(shù)通過閥切換將處理試樣與分析統(tǒng)一在一個系統(tǒng)中,不僅增加了處理樣品的安全性,而且減少了人為因素的影響,提高了方法的準確度和精密度[4-5]。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)集液相色譜高效的在線分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體,已成為法醫(yī)毒物分析強有力的工具。多反應監(jiān)測(MRM)模式通過兩次離子選擇作用,鎖定目標物的母離子-子離子對,提高了分析的專一性和靈敏度[6]。本工作通過儀器改裝,將柱切換技術(shù)與LC/MS聯(lián)用,尿樣直接進樣分析嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙?？纱?。
要實現(xiàn)柱切換,儀器至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥。實驗室在購買了整套的Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀后,為了實現(xiàn)在線前處理(即柱切換功能),又增配了1臺 Waters 1525高壓二元泵和1個十通切換閥。通過內(nèi)部流路的重新連接和改裝,用Alliance 2695的進樣器實現(xiàn)大體積進樣,1525高壓二元泵輸送預處理流動相,樣品在預處理柱上被凈化和富集,沖洗一定時間(即預處理時間)后,通過十通切換閥,使分析流動相進入預處理柱,把被測組分沖入Alliance 2695的流路中,經(jīng)過一定時間(即切換時間)后,十通切換閥又切換成原狀,Alliance 2695繼續(xù)輸送分析流動相進行色譜柱分離,并最終進入到Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中進行檢測,預處理柱則平衡準備下一次進樣。切換過程示于圖1。
1 實驗部分
1.1 儀器和試劑
Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀:美國 Waters公司產(chǎn)品,配有 Waters 1525高壓二元泵,Mass Lynx V4.1軟件,十通切換閥。
對照品:由中國藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標嗎啡-d3:美國Cerilliant公司產(chǎn)品。
乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨(色譜純):購自德國Merck公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純;水為自制超純水。
儲備液:固體對照品配成1.0 g/L甲醇溶液,再按照濃度配成混合稀釋液。內(nèi)標配成濃度為0.1 g/L甲醇溶液。
1.2 儀器條件
1.2.1 液相色譜條件 1)預處理柱型號:Oasis?HLB 2.1 mm×20 mm×25μm;預處理柱柱溫:室溫;預處理流動相:水;流速:1.0 mL/min;切換時間:0.60～3.00 min。2)分析柱型號:Xterra?MS C182.1 mm×150 mm×3.5 μm;分析柱柱溫:35 ℃;分析流動相 A:2 mmol/L甲酸銨和 0.05%甲酸的水溶液(0.126 g甲酸銨和 500μL甲酸,加水至 1 000 mL);分析流動相B:2 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈(0.126 g甲酸銨和500μL甲酸溶于40 mL水中,加入960 mL乙腈);流速:0.2 mL/min;梯度洗脫:0 min 90%A 10%B,5 min 90%A 10%B;7 min 40%A 60%B,12 min 40%A 60%B,12.05 min 90%A 10%B;進樣量:100μL。
圖1 柱切換過程示意圖Fig.1 Schematic representation of the column-switching set-up
1.2.2 質(zhì)譜條件 多反應監(jiān)測(MRM)模式,正離子掃描,電噴霧電壓3 200 V,霧化氣(N2)流速600 L/h,錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h,離子源溫度105℃,碰撞氣為氬氣。
1.2.3 MRM參數(shù) 每個化合物設(shè)2對母離子-子離子對,各參數(shù)列于表1。
表1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標的質(zhì)譜MRM參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters and diagnostic ions for morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2 結(jié)果
2.1 色譜圖
嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標在選定的液相色譜分析條件下,保留時間分別為 6.01、7.69、9.58、10.80、6.01 min,色譜行為良好,總離子流色譜圖示于圖2。
2.2 檢測限
當信噪比(S/N)為3時,各化合物的檢測限列于表2。
圖2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2.3 線性關(guān)系和精密度
分別取不同量的對照品混合液于具塞尖底試管中,吹干后加入空白尿樣配成系列濃度的樣品。以峰面積與內(nèi)標峰面積之比(y)對樣品中化合物的濃度(x)作圖,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),各化合物的線性關(guān)系良好(表2)。高、中、低濃度日內(nèi)重復測定6次得日內(nèi)精密度,連續(xù)測定4天得日間精密度,列于表3。
2.4 案例應用
本方法已經(jīng)應用于多起實際案件的吸毒尿樣分析,其中一例吸毒致死案件的尿樣檢材中檢出嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虺煞?色譜圖示于圖3。
表2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因的檢測限和線性關(guān)系Table 2 The limit of detection,linear equation and coefficient of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,and acetylcodeine
表3 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻娜諆?nèi)及日間精密度Table 3 Intra-and inter-day precision of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine and acetylcodeine
圖3 一例吸毒致死案件的尿樣色譜圖Fig.3 Chromatogram of a case
3 討論
在線固相萃取(SPE)的主要優(yōu)點有:1)前處理簡單,自動化操作,樣品只需簡單處理或不經(jīng)處理即可進樣分析,因此也適用于不穩(wěn)定藥物的分析;2)富集被測組分,提高了分析靈敏度,尤其是水溶性較大的組分,無法用液-液萃取時,HPLC柱切換技術(shù)則很有效;3)由于進樣體積較大,處理樣品的全過程由儀器程序控制,可獲得很高的精密度與重現(xiàn)性。
采用柱切換方法,切換時間的確定至關(guān)重要。通過實驗確定預處理流動相的沖洗時間,初始為狀態(tài)1,預處理柱和分析柱是并聯(lián)狀態(tài),進樣后各化合物富集、保留在預處理柱上,0.60 min后切換到狀態(tài)2,既可除去尿液中的水溶性雜質(zhì)和鹽類,又使峰面積達到最大化,時間增加或者減少峰面積均減小。在狀態(tài)2時,預處理柱和分析柱串聯(lián)在一起,分析流動相將保留在預處理柱上的化合物洗脫進入分析柱,3.00 min后回到狀態(tài)1,化合物繼續(xù)在分析柱上完成分離,時間增加峰面積不再增加,僅保留時間延長,因此確定切換時間為0.60～3.00 min。
液相色譜分析條件的確定:以乙腈和水作為流動相主體,由于樣品離子化的需要,在水中需要加入甲酸和甲酸銨,其中甲酸主要起到改善峰形的作用,甲酸銨可以提高儀器信號的響應值。由于梯度洗脫會影響色譜峰面積的穩(wěn)定性,通過在乙腈中加入相同濃度的甲酸和甲酸銨,保證梯度變化過程中甲酸和甲酸銨的濃度一致,改善了色譜峰面積的穩(wěn)定性。嗎啡類生物堿水溶性較大,在色譜柱上不易保留,由于母體結(jié)構(gòu)相似,碎片離子也相同,為了方法定性定量的準確性,避免相互干擾,有必要使分析的化合物能在保留時間上分開,于是采用了初始為10%水相的梯度洗脫,各化合物得到良好的分離。
[1]何國標,蔣碩勤,羅正堅.嗎啡類毒品的固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定[J].分析測試學報,2008,27(增刊):11-12.
[2]朱彬玲.尿中O6-乙酰嗎啡的膜式固相萃取及 GC/MS/SIM測定[J].漳州師范學院學報,2007,20(2):88-91.
[3]呂海茹.尿中嗎啡常見檢測方法[J].刑事技術(shù),2008,2:29-31.
[4]梁 晨,郭幼梅,金琦蕓,等.柱切換高效液相色譜法測定尿中苯駢二氮雜卓類藥物[J].中國臨床藥學雜志,2003,12(3):157-160.
[5]JAGERDEO E,MONTGOMERY M A,L EBEAU M A,et al.An automated SPE/LC/MS/MS method for the analysis of cocaine and metabolites in whole blood[J].Journal of Chromatography B,2008,874(1/2):15-20.
[6]向 平,沈 敏,沈保華,等.生物檢材中嗎啡類生物堿的LC-MS/MS分析[J].法醫(yī)學雜志,2006,22(1):52-57.
猜你喜歡
家庭科學·新健康(2022年2期)2022-03-07 06:13:38
介入放射學雜志(2022年11期)2022-03-04 04:02:41
醫(yī)藥前沿(2020年23期)2020-12-03 04:08:05
時代英語·高一(2018年5期)2018-11-19 10:55:06
時代英語·高一(2017年5期)2017-11-14 15:52:20
大眾醫(yī)學(2017年3期)2017-03-21 19:42:40
環(huán)球時報(2016-05-18)2016-05-18 08:49:41
色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:30
中國環(huán)境科學(2015年7期)2015-01-28 11:41:53
西南軍醫(yī)(2015年2期)2015-01-22 09:09:44
