結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胰腺癌中的表達(dá)及臨床意義

鄭 剛，劉建生，智仁厚

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，山西太原 030001

“腫瘤微環(huán)境”的概念由美國(guó)Anderson腫瘤研究中心的Ioannides和匹茲堡大學(xué)的Whiteside第一次正式提出[1]，腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境除了有各種因子的相互作用外，由于腫瘤的快速增長(zhǎng)，耗氧較多，從而形成了一個(gè)缺氧的微環(huán)境。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）是1991年Bradham等應(yīng)用血小板源性生長(zhǎng)因子抗體篩選人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，可與多種因子相互作用，在細(xì)胞的增殖、黏附、遷移以及血管生成、炎癥反應(yīng)和組織重構(gòu)等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前在胰腺癌中的作用還不明確，尤其是其在體內(nèi)和體外環(huán)境中對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用爭(zhēng)議較大?？赡芘c胰腺癌特殊的腫瘤微環(huán)境有關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生成重要的因子之一，在很多病理生理情況下的血管形成中發(fā)揮重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子-1（laypoxia.inducible factor-1,HIF-1）在腫瘤的抗缺氧代謝中起中樞紐帶的作用。本研究通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)胰腺癌和癌旁正常組織中CTGF、VEGF、HIF-1α的表達(dá)情況，探討其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科2003年1月～2009年12月行手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本46例，經(jīng)病理診斷均為導(dǎo)管腺癌。其中，男22例，女24例；年齡31～77歲，平均（58.23±10.31）歲。術(shù)前均未接受放化療，臨床資料完整。另取10例癌旁胰腺組織作為對(duì)照。

1.2 方法

標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，HE染色復(fù)述病理組織學(xué)特征，再進(jìn)行Envision兩步法免疫組化染色，光鏡觀察。用已知胰腺癌陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照，用0.05%PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。一抗CTGF（sc-14939 Santa Cruz產(chǎn)品），及其對(duì)應(yīng)二抗兔抗羊PV9003（Santa Cruz產(chǎn)品）；一抗VEGF、二抗鼠抗兔 PV6001、染色試劑盒均購(gòu)自北京中衫公司；一抗HIF-1α購(gòu)自北京博奧森公司。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，三者的最佳濃度均調(diào)至1∶100，CTGF用EDTA液高溫高壓修復(fù)2.5 min，VEGF、HIF-1α用枸櫞酸鈉液高溫高壓修復(fù)2 min，其余步驟均按使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 結(jié)果判斷

CTGF、VEGF、HIF-1α的陽(yáng)性判斷為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。400倍鏡下任取5個(gè)視野，在雙盲條件下，由2名病理科主任醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行觀察，結(jié)果判定采用半定量積分分級(jí)。采用胡驍?shù)臉?biāo)準(zhǔn)[2]，標(biāo)準(zhǔn)如下，

①染色強(qiáng)度：0分為無(wú)色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0分為陽(yáng)性細(xì)胞占0%，1分為25%，2分為 26～50%，3分為 51～75%，4分為＞75%。以上兩項(xiàng)積分相加為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0 分為（-），2～3 分為（±），4～5 分為（+），6～7 分為（++），其中（+）和（++）判定為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTGF、VEGF和HIF-1α在胰腺癌和癌旁正常組織中的表達(dá)

CTGF、VEGF和HIF-1α在正常胰腺組織中均為0（0/10）表達(dá)，而在癌組織中均高表達(dá)，陽(yáng)性率分別為45.7%（21/46）、71.7%（33/46）、76.1%(35/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 CTGF、VEGF和HIF-1α表達(dá)與胰腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系

CTGF在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與性別、腫瘤部位無(wú)關(guān)，而與年齡、臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等有關(guān)（P＜0.05），年齡越大、分化程度越低，臨床分期越晚，陽(yáng)性表達(dá)率越高。VEGF和HIF-1α在胰腺癌組織中的表達(dá)只與臨床分期有關(guān)（P＜0.05），與其他腫瘤生物學(xué)行為無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

2.3 CTGF、VEGF和HIF-1α在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性檢測(cè)，CTGF 與 VEGF、HIF-1α；VEGF 與 HIF-1α 之間的 Spearman 相關(guān)系數(shù)分別為：r=0.575、r=0.483、r=0.082，即三者兩兩間均存在正相關(guān)關(guān)系（均P＜0.01）。

3 討論

腫瘤微環(huán)境對(duì)胰腺癌的形成和發(fā)展發(fā)揮了重要作用，腫瘤在快速生長(zhǎng)的過(guò)程中，消耗大量的氧，形成缺氧的局部微環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠胰腺原位移植瘤VEGF表達(dá)明顯增加，而異位移植瘤的VEGF表達(dá)不明顯，說(shuō)明胰腺原位微環(huán)境可促進(jìn)癌細(xì)胞VEGF表達(dá)，增進(jìn)血管生成[3]。VEGF是血管生成的主要調(diào)節(jié)者，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并具有血管通透性作用[4]，增加腫瘤局部環(huán)境的血流量，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。

表1 CTGF、VEGF和HIF-1α表達(dá)與胰腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系[n(%)]Tab.1 Relationship between expressions of CTGF,VEGF,HIF-1α and tumor biological behaviour[n(%)]

HIF-1α是HIF-1的調(diào)節(jié)及活性亞基，在缺氧環(huán)境下作為機(jī)體細(xì)胞特異性應(yīng)答的中介產(chǎn)物，誘導(dǎo)多種因子生成對(duì)抗缺氧，VEGF是其最重要的靶基因，HIF-1α上調(diào)VEGF表達(dá)并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，對(duì)胰腺癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)起重要作用。Biichler等[5]發(fā)現(xiàn)胰腺癌中HIF-1α mRNA表達(dá)上調(diào)，且與VEGF mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，說(shuō)明HIF-1α通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成，促進(jìn)胰腺癌生長(zhǎng)。

CTGF在結(jié)締組織豐富的胰腺癌組織發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[6]，但具體作用還不明確。蘇燕等的研究表明CTGF在體外對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[7]。但是Bennewith等[8]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的CTGF在體內(nèi)環(huán)境下高表達(dá)，并且對(duì)胰腺癌的生長(zhǎng)發(fā)展起重要作用；抑制內(nèi)源性CTGF表達(dá)，胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)在體外及皮下均受到明顯抑制，而CTGF在胰腺癌組織中的作用主要是對(duì)抗缺氧；在體外試管缺氧條件下，同樣可以檢測(cè)到CTGF的高表達(dá)。缺氧能誘導(dǎo)CTGF表達(dá)，CTGF和VEGF在血管的生成重構(gòu)中起重要作用[9]。CTGF在不同環(huán)境下對(duì)胰腺癌細(xì)胞的不同作用，很可能跟缺氧微環(huán)境的條件有關(guān)。

本研究通過(guò)檢測(cè)CTGF、VEGF和HIF-1α，三者在46例胰腺癌組織中均存在異常高表達(dá)。CTGF的表達(dá)隨著惡性程度的增高而增加，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及年齡有關(guān)，提示CTGF的表達(dá)增高與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展，腫瘤惡性程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。VEGF和HIF-1α在46例癌中分別有33、35例表達(dá)，顯著高于癌旁組織（P＜0.01）。腫瘤的臨床分期越晚，VEGF和HIF-1α的表達(dá)越高，提示兩者與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。CTGF、VEGF和HIF-1α三者在胰腺癌中的表達(dá)，兩兩之間均呈正相關(guān)，提示三者在胰腺癌的缺氧微環(huán)境中共同對(duì)抗缺氧，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展起重要作用。CTGF在胰腺癌組織的病理分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上可作為一個(gè)較好的臨床檢驗(yàn)指標(biāo)。聯(lián)合檢測(cè)CTGF、VEGF和HIF-1α的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)胰腺癌預(yù)后的一個(gè)客觀指標(biāo)，對(duì)胰腺癌的預(yù)后判斷有重要意義。

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