復(fù)方參蛇洗劑的研制和評價

李 晏(解放軍第411醫(yī)院，上海200081)

復(fù)方參蛇洗劑來源于民間驗方(含苦參、蛇床子、黃柏等15味中國藥典［1］收載中藥)，具有祛風(fēng)殺蟲、消炎止癢的功效，臨床用于急性濕疹、疥瘡、手足癬、皮炎等引起的皮膚瘙癢癥。為提高該制劑質(zhì)量，保證患者用藥的安全有效，筆者對該制劑制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥效學(xué)進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);高效液相色譜儀(美國WATERS公司，515 HPLC泵，Rheodyne7725i定量進(jìn)樣器，996 photodiode array檢測器，millennium 32色譜數(shù)據(jù)工作站);DK-S12型電熱恒溫水浴鍋(上海華聯(lián)醫(yī)療器材有限公司);PB-10型 pH計(Sartorious pH計)，SK-1200H型超聲處理器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 復(fù)方參蛇洗劑(自制，批號為000001，000002，000003);苦參堿對照品(中國藥品生物制品檢定所)。潔爾陰洗液(成都恩威制藥有限公司，批號091205);二甲苯(上?；瘜W(xué)試劑商店);注射用青霉素 G鉀(上海新先鋒藥業(yè)有限公司，批號090502);硫酸鏈霉素(上海嘉辰化工有限公司，批號090609);磷酸組織胺(中國藥品生物制品檢定所，批號510910，規(guī)格25 mg/支)。

1.3 動物與菌種 動物:昆明種小白鼠50只，雌雄兼用，體重18～22 g;Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重120～180 g。豚鼠50只，雌雄兼用，體重260～400 g。以上動物均購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。菌種:致病性大腸桿菌(26001)、傷寒沙門氏菌(88087)、福氏志賀氏菌2a(51536)、金黃色葡萄球菌(26001)、綠膿桿菌(10104)、乙型溶血性鏈球菌(32172)、肺炎雙球菌(31002)，均購自上海市藥檢所，均為標(biāo)準(zhǔn)菌株。

培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠);10%羊血瓊脂(以營養(yǎng)瓊脂為營養(yǎng)培養(yǎng)基加入新鮮的脫纖維羊血至10%濃度);營養(yǎng)肉湯和10%小牛血清肉湯(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方參蛇洗劑的水煮醇沉工藝的優(yōu)化 本研究選定煎煮時間、醇沉濃度作為考察因素，每個因素各設(shè)三個水平進(jìn)行正交設(shè)計試驗，以優(yōu)選苦參等提取工藝。提取物提取率的測定:分別量取1～9號實驗各浸提液適量(相當(dāng)于生藥2 g)置蒸發(fā)皿中水浴蒸干后，60℃減壓干燥至恒重，取出，放置干燥器中冷卻30 min，精密稱定，除去蒸發(fā)皿的重量，計算提取物提取率。結(jié)果見表1。

表1 苦參等提取后的苦參堿正交試驗表

極差分析結(jié)果D＞A＞B＞C，優(yōu)選D3A3B3C2。從節(jié)能和省時方面考慮，B選2水平，C選1水平為好。因此，合理提取工藝條件為D3A3B2C1。即煎煮的時間依次為2，1，0.5 h，合并3次煎液，過濾，濾液濃縮至密度為1.05～1.08(60～65℃)，冷卻至室溫時，攪拌并緩慢加入乙醇，使乙醇量達(dá)70%，靜置15min，過濾取清夜，回收乙醇，濃縮得濃縮液備用。

2.2 復(fù)方參蛇洗劑的制備工藝 取苦參、蛇床子、黃柏等15味中藥，加入水超過藥面，共煎煮3次。在煎煮過程中，隨時補(bǔ)充蒸發(fā)失去的水分，蒸煎的時間依次為2，1，0.5 h，合并三次煎液，濾過濾液，濃縮至相對密度為1.05～1.08(60～65℃)，冷卻至室溫時，攪拌并緩慢加入乙醇，使乙醇量達(dá)70%，靜置15 min，濾取清液，回收乙醇，濃縮得濃縮液，使成為1∶10(即1ml濃縮液相當(dāng)于10 g藥材)，相對密度為1.18～1.22(80～85℃)，加入基質(zhì)、去離子水?dāng)嚢杈鶆颍嘌b成瓶，熱合包裝，印字成品，按方量制成洗劑，每瓶量200 ml。

2.3 pH、裝量和微生物檢查

2.3.1 pH值 取本品1ml，加10倍的水稀釋成溶液，依法測定(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅦG)，3個批號的樣品的pH測定結(jié)果符合pH為6.0～7.0的標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 裝量 取本品3瓶，將內(nèi)容物分別傾入經(jīng)校正的干燥量筒中，黏稠液體傾出后，將容器倒置15 min，傾凈。讀出每個容器內(nèi)容物的裝量，并求出平均裝量。經(jīng)試驗，3批樣品的裝量均不少于平均裝量的95%，符合規(guī)定。

2.3.3 微生物限度 取本品，按照微生物限度檢查法(中國藥典2010年版一部附錄ⅧC)的規(guī)定進(jìn)行檢查，3個批號的樣品測定結(jié)果均符合規(guī)定。

2.4 含量測定 以高效液相色譜法［2，3］測定制劑中苦參堿的含量。

2.4.1 色譜條件 儀器 美國WATERS公司，515 HPLC泵，Rheodyne7725i定量進(jìn)樣器，996 photodiode array檢測器，millennium 32色譜數(shù)據(jù)工作站。色譜柱:Kromsail C18柱;流動相∶乙腈-0.02三乙胺溶液(30∶70);流速:1.0 ml/min;檢測波長:220 nm.

測定法:對照品溶液的制備，精密稱取苦參堿對照品適量，加甲醇制成每1 ml中約含1 mg的對照品溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。供試品溶液的制備，精密量取裝量差異檢查項下的本品5 ml，加水5 ml超聲溶解，蒸干，殘渣用甲醇5 ml溶解，超聲，離心，取上清液過濾，即得。分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。

2.4.2 方法學(xué)考察

2.4.2.1 線性關(guān)系 取苦參堿對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 ml，置10 ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10.06、20.12、40.24、80.48、120.72 μg/ml的溶液，作為苦參堿對照品溶液。分別取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。X為苦參堿對照品的濃度，Y為峰面積。Y=0.589 7X－0.695 6，r=0.999 9;結(jié)果表明苦參堿在10.06～120.72 μg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2.2 精密度 分別取濃度為20.12、40.24、80.48 μg/ml的苦參堿對照品溶液，照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考查日內(nèi)精密度。取濃度為20.12 μg/ml的苦參堿對照品溶液，照上述色譜條件，連續(xù)3天，每天進(jìn)樣3次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，考查日間精密度。日內(nèi)精密度和日間精密度RSD分別為0.62%和1.05%，符合測定要求。

2.4.2.3 穩(wěn)定性 精密吸取上述制備的供試品溶液，照上述色譜條件，每隔2 h進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣5次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD為1.23%，符合測定要求。

2.4.2.4 加樣回收率 精密量取已測知含量的復(fù)方參蛇洗劑(批號000001)2.5 ml，按80%、100%和120%的比例，精密加入苦參堿對照品適量，分別稱取3份，共9份，按含量測定項下的條件和方法測定，計算回收率，平均回收率為(96.25±0.79)%。從回收試驗結(jié)果可以看出，方法的準(zhǔn)確度較好。

2.4.2.5 樣品測定 以上述方法測定3批樣品，結(jié)果每100 ml樣品中的苦參堿含量分別為(11.2± 1.1)mg;(11.6±0.8)mg;(10.8±0.5)mg。結(jié)果得3批樣品每100 ml中含苦參堿的量都不少于10 mg。

2.5 抗炎作用評價

2.5.1 小鼠耳廓二甲苯致炎試驗 動物隨機(jī)分為5組，每組10只。對照組;潔爾陰組(10%v/v，0.05 ml/20 g);復(fù)方參蛇洗劑3個劑量組(5%、10%、20%v/v、0.05 ml/20 g)。試驗當(dāng)日各組涂藥一次，對照組涂以相同量蒸餾水0.05 ml/20 g。1 h后各給藥組以蒸餾水洗去藥液，用干棉球擦凈。給小鼠右耳涂以二甲苯0.05 ml/只，左耳作對照，15 min后處死動物，用直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，分析天平稱重，以左耳、右耳片重量之差為腫脹程度。計算各組腫脹度，求出腫脹抑制率(%)，結(jié)果見表2。復(fù)方參蛇洗劑有明顯抑制小鼠耳廓腫脹的作用，潔爾陰亦有同樣的作用。

表2 復(fù)方參蛇洗劑對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

2.5.2 大鼠蛋清足跖腫脹試驗 將大鼠60只隨機(jī)分6組，①對照組;②潔爾陰組(成品的10%，0.1 ml/100 g);③～⑤復(fù)方參蛇洗劑大、中、小劑量組(成品的20%，10%，5%v/v 0.1 ml/100 g);⑥復(fù)方參蛇洗劑基質(zhì)組(10%v/v，0.1 ml/100 g)。實驗前按毛細(xì)管放大測量法測定各組大鼠右后足的正常體積(ml)，實驗當(dāng)日各給藥組涂藥1 h后，各組右后足跖皮下注射100%新鮮蛋清0.05 ml/只，同時再涂藥一次，對照組涂以等量蒸餾水0.1 ml/100 g。測定致炎后1、2、4、6 h的右后足體積。各大鼠致炎前后足體積的差值為腫脹度，比較各組腫脹度的差異。

表3 復(fù)方參蛇洗劑對大鼠蛋清性足跖腫的影響

由表3可見，復(fù)方參蛇洗劑大、中、小3個劑量組隨著劑量增大其抑制大鼠足跖腫脹的作用加強(qiáng)。中劑量組致炎后2、4 h，大劑量組致炎后1～4 h與對照組比較皆有顯著性差異。陽性藥潔爾陰亦有抑制炎癥的作用。復(fù)方參蛇洗劑基質(zhì)組無抗炎作用。結(jié)果表明，復(fù)方參蛇洗劑有明顯的抗炎作用，而基質(zhì)無抗炎作用。潔爾陰亦有抗炎作用。

2.6 抑菌作用評價 取滅菌小試管若干支，用相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋被試藥，其最終濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25及0.003 125 g/ml，每管裝1 ml。每管加入0.1 ml稀釋的新鮮菌液，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h后觀察有無細(xì)菌生長，如果藥物顏色深或不透明，無法判定有無細(xì)菌生長時，把可疑的管再移種到平皿培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 h后觀察有無細(xì)菌生長。細(xì)菌不生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低抑菌濃度。

結(jié)果表明:由表4可見，復(fù)方參蛇洗劑是無菌的，置37℃培養(yǎng)18 h沒有細(xì)菌生長。復(fù)方參蛇洗劑對金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、傷寒沙門氏菌、致病性大腸桿菌、福氏志賀氏菌等均有不同程度的抑菌作用。對綠膿桿菌無抑制作用。

2.7 止癢作用評價 將豚鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。①對照組;②潔爾陰組(10%，0.1 ml/100 g);③復(fù)方參蛇洗劑大劑量組(20%v/v，0.1 ml/ 100 g);④復(fù)方參蛇洗劑中劑量組(10%v/v，0.1 ml/100 g);⑤復(fù)方參蛇洗劑小劑量組(5%v/v，0.1 ml/100 g)。

試驗前一日，給各組豚鼠右后足背剃毛，涂藥一次。試驗當(dāng)日，用粗砂紙擦傷右后足背剃毛處，面積1平方厘米，局部再涂藥一次，對照組給予等量蒸餾水。末次涂藥后10 min，開始在創(chuàng)面處滴0.01%磷酸組織胺0.05 ml/只。直至出現(xiàn)豚鼠回頭舔右后足，以最后出現(xiàn)豚鼠回頭舔右后足時所給予的磷酸組織胺總量為致癢閾。記錄并比較各組的致癢閾。

表4 復(fù)方參蛇洗劑抑菌試驗結(jié)果(液體試管法)

表5 復(fù)方參蛇洗劑對磷酸組織胺致癢反應(yīng)的影響

由表5可見，復(fù)方參蛇洗劑大劑量組有明顯提高豚鼠致癢閾的作用，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);中劑量組亦有較顯著的提高致癢閾的作用(P＜0.05)。潔爾陰組致癢閾與對照組相比有極顯著的差異(P＜0.01)。

3 討論

復(fù)方參蛇洗劑以苦參、蛇床子、黃柏等為主要藥物，其中苦參清熱燥濕、解毒殺蟲、祛風(fēng)止癢為君藥;黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，蛇床子祛風(fēng)燥濕、殺蟲止癢共為臣藥，以協(xié)助苦參的作用。苦參主要有效成分是苦參堿和氧化苦參堿，具有良好的調(diào)節(jié)免疫和抗過敏作用［4］。

通過本研究，制備工藝中中藥成分的提取方案得到了優(yōu)化，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)針對方中主藥采用了專屬性較強(qiáng)的HPLC測定法，提高后的檢查項較以前更為合理。藥效學(xué)研究印證了復(fù)方參蛇洗劑在臨床上殺菌、消炎和止癢的功效。制劑制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥效學(xué)研究結(jié)果表明研制的復(fù)方參蛇洗劑具有一定的臨床應(yīng)用前景。

［1］ 中國藥典2010年版.二部［S］.2010:461.

［2］ 張 杰，向大雄，羅杰英.等.反相高效液相色譜法測定苦參藥材中苦參堿的含量［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24(11): 718.

［3］ 劉 斌，石任兵，周素蓉.苦參湯有效部位總生物堿含量測定方法研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2004，27(2):76.

［4］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社.1975:2121.