麻黃加術(shù)湯對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型作用機(jī)制的研究

徐 琦 ，尹抗抗 ，譚達(dá)全 ，鄧冰湘 *

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級碩士研究生班，湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

麻黃加術(shù)湯對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型作用機(jī)制的研究

徐 琦1，尹抗抗2，譚達(dá)全2，鄧冰湘2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2008級碩士研究生班，湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 探討麻黃加術(shù)湯對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法 運(yùn)用Ⅱ型膠原法建立Wistar大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，采用麻黃加術(shù)湯給予干預(yù)，以甲氨喋呤片為陽性對照藥。將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、甲氨喋呤組、麻黃加術(shù)湯組。檢測大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α濃度，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理改變。結(jié)果 麻黃加術(shù)湯可顯著降低大鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），對CIA大鼠滑膜組織的炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生和巨噬樣A型細(xì)胞有明顯抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 麻黃加術(shù)湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與降低炎性因子IL-1β、TNF-α的水平，抑制炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生和巨噬樣A型細(xì)胞增生有關(guān)。

麻黃加術(shù)湯；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；IL-1β；TNF-α；滑膜組織；大鼠；麻黃；桂枝；杏仁

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種常見的以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵直、變形為主要表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病，早期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)游走性疼痛和功能障礙，晚期則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬、畸形，甚至廢而不用，具有發(fā)病廣泛、病程較長、致殘率高、不易治愈等特點(diǎn)。在中醫(yī)學(xué)中，RA屬于“尪痹”范疇。麻黃加術(shù)湯是仲景《金匱要略》中主治“濕家身煩疼”的方劑，本文旨在研究麻黃加術(shù)湯對實(shí)驗(yàn)大鼠血清IL-1β、TNF-α的調(diào)節(jié)作用及對實(shí)驗(yàn)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜的影響，進(jìn)一步探討該藥物治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠40只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量(150±15)g。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號：scxk（湘）2009-0004。在SPF級實(shí)驗(yàn)室飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物 麻黃加術(shù)湯（麻黃、桂枝、炙甘草、杏仁、白術(shù)）濃縮煎液，制備成含生藥9 g/10 mL的試藥，由湖南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑科提供；甲氨蝶呤片（MTX）（上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，批號110029）。

1.1.3 試劑 Ⅱ型膠原蛋白與弗氏不完全佐劑（IFA）（sigma公司產(chǎn)品）；IL-1β 試劑盒與 TNF-α 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品）。

1.1.4 儀器 天平高速冷凍離心機(jī)（CR21型，HITAHI生產(chǎn)）；電子天平（AB204-N意大利生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備［1］用0.1 mol/L醋酸溶解Ⅱ型膠原蛋白(2 mg/mL，4℃，過夜)，再與等量的 IFA混合，于冰浴中充分乳化。用生理鹽水配置2%戊巴比妥鈉麻醉劑，按0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉。用手術(shù)剪剪掉尾根部皮毛，75%乙醇消毒。取乳化后大鼠CIA造模劑，除正常組外，按0.4 mL/只于大鼠尾根部、背部、右后肢足趾多點(diǎn)皮內(nèi)注射。見到局部圓形皮丘腫起，為注射成功。造模后第7天按原方法注射Ⅱ型膠原蛋白0.2 mL/只做加強(qiáng)免疫1次。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 所有動(dòng)物稱體質(zhì)量，編號后，隨機(jī)抽取10只（雌雄各半）為空白組，其余動(dòng)物為造模組。造模組，動(dòng)物造模后第5周，按體質(zhì)量分層，隨機(jī)再分為3組（模型組、甲氨喋呤組、麻黃加術(shù)湯組），每組10只。實(shí)驗(yàn)第5周開始定時(shí)灌胃治療，甲氨喋呤組給予甲氨喋呤片混懸液灌胃，每周1次，給藥劑量均按70 kg成人體表面積換算，大鼠160 g體質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，大鼠和人用藥量按單位質(zhì)量用藥量換算系數(shù)6.25計(jì)算[2]大鼠用藥劑量為0.89 mg/kg；麻黃加術(shù)湯組動(dòng)物給予麻黃加術(shù)湯灌胃，根據(jù)實(shí)驗(yàn)大鼠和人用藥量按單位重量用藥量換算系數(shù)計(jì)算，確定為18.75 mL/kg；每天1次，空白組和正常組給予等體積蒸餾水灌胃。連續(xù)用藥4周。

1.2.3 IL-1β，TNFa檢測 于末次給藥結(jié)束后2 h收集標(biāo)本。在大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min 后，離心（2 000 r/min，15 min），取上清，置冰箱中以供檢測IL-1β、TNF-α。應(yīng)用武漢博士德生物工程公司提供的白細(xì)胞介素-1β放免藥盒和腫瘤壞死因子-α放免藥盒測定大鼠血清白細(xì)胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α。根據(jù)說明書中步驟進(jìn)行操作。在標(biāo)本中加入分離劑后充分混勻，放室溫20 min，4℃離心3 500 r/min 25 min，吸取上清液，用Υ計(jì)數(shù)器測試放射性。以B/T計(jì)算NSB、50結(jié)合百分率，以B/BO計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測樣品結(jié)合百分率，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值?；蛴勺詣?dòng)Υ計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

1.2.4 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理組織切片 完整分離膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用刀片完整切下，以多聚甲醛液固定，脫水，包埋，切片，HE染色。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室協(xié)助制作病理切片。按炎性細(xì)胞浸潤、巨噬A型細(xì)胞增生、滑膜增生、纖維組織增生4個(gè)方面病理改變，按以下標(biāo)準(zhǔn)分4級進(jìn)行評價(jià)計(jì)分[3]：(1)炎性細(xì)胞浸潤:無炎性細(xì)胞浸潤為0分，炎性細(xì)胞浸潤少于20個(gè)/高倍視野(HF)為1分，20～50個(gè)/HF為2分，大于50個(gè)/HF為3分；(2)巨噬A型細(xì)胞增生:無巨噬A型細(xì)胞增生為0分，少于10個(gè)/HF為1分，10～20個(gè)/HF為 2分，大于20個(gè)/HF為 3分；（3）滑膜增生:滑膜細(xì)胞扁平，數(shù)量不多為0分，滑膜細(xì)胞腫脹，密集單層排列為1分，滑膜細(xì)胞腫脹，密集2層排列為2分，滑膜細(xì)胞腫脹，密集3層以上排列為3分；(4)纖維組織增生:無纖維組織增生為0分，平均增生少于0.2個(gè)/HF為1分，平均增生0.2～0.4個(gè)/HF為2分，平均增生大于0.4個(gè)/HF為3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 麻黃加術(shù)湯對大鼠血清中的IL-1β、TNF-α含量的影響

模型組大鼠血清IL-1β與空白組比較明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明模型組大鼠炎性反應(yīng)明顯。甲氨喋呤組、麻黃加術(shù)湯組均可下調(diào)大鼠血清中IL-1β含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。模型組大鼠血清 TNF-α與空白組比較明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明模型組大鼠炎性反應(yīng)明顯。甲氨喋呤組、麻黃加術(shù)湯組均可下調(diào)大鼠血清TNF-α含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），麻黃加術(shù)湯組抗炎作用優(yōu)于甲氨喋呤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示麻黃加術(shù)湯調(diào)控相關(guān)炎性細(xì)胞分泌TNF-α因子的能力最強(qiáng)，能更好的減輕大鼠炎癥反應(yīng)，使關(guān)節(jié)損傷逐漸減輕。見表1。

表1 麻黃加術(shù)湯對CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量的影響 （n=10，ng/mL，）

表1 麻黃加術(shù)湯對CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α 含量的影響 （n=10，ng/mL，）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；與甲氨喋呤組比較★P＜0.05。

組 別 劑量（mg/kg） IL-1β TNF-α空白組 — 0.187±0.035△△ 1.354±0.114△模型組 — 0.306±0.049 1.898±0.137甲氨喋呤組 0.89 0.253±0.042△ 1.567±0.108△△麻黃加術(shù)湯組 18.75 0.229±0.044△△ 1.458±0.169△△★

2.2 麻黃加術(shù)湯、甲氨喋呤對大鼠滑膜組織病理分級的影響

麻黃加術(shù)湯組、氨喋呤組與模型組在炎性細(xì)胞浸潤、巨噬A型細(xì)胞增生、滑膜增生、纖維組織增生、總積分5個(gè)方面的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），說明兩者均具有改善RA關(guān)節(jié)滑膜病變的作用。麻黃加術(shù)湯組改善RA關(guān)節(jié)滑膜病變的作用優(yōu)于甲氨喋呤組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 麻黃加術(shù)湯對CIA大鼠滑膜組織病理分級的影響 （n=10，）

表2 麻黃加術(shù)湯對CIA大鼠滑膜組織病理分級的影響 （n=10，）

注：與模型組比較△P＜0.05，△△ P＜0.01；與甲氨喋呤組比較★P＜0.05。

組 別 藥物劑量（mg/kg） 炎性細(xì)胞浸潤 巨噬A型細(xì)胞增生 滑膜增生 纖維組織增生 總積分空白組 - 0.75±0.45 0.66±0.49 0.58±0.51 1.25±0.62 0.67±1.63模型組 - 2.33±0.78 2.33±0.65 2.41±0.67 2.41±0.51 5.83±1.72甲氨蝶呤組 0.89 1.50±0.90△ 1.50±0.80△ 1.67±0.64△ 1.51±0.90△△ 3.83±1.83△麻黃加術(shù)湯組 18.75 1.33±0.89△△ 1.33±0.89△△ 1.50±0.80△△ 1.50±1.00△△ 1.83±1.60△△★

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué) “尪痹”的范疇，“尪痹”歷代醫(yī)家稱為“歷節(jié)病 ”又名“鶴膝風(fēng)”，表現(xiàn)為經(jīng)久不愈，好發(fā)于小關(guān)節(jié)，主要表現(xiàn)為疼痛、腫脹、僵直、畸形、骨質(zhì)改變，筋縮肉卷，肢體不能屈伸。本病的病機(jī)多為先天不足，后天不濟(jì)，氣血兩虧，或病后、產(chǎn)后機(jī)體防御能力低下，衛(wèi)外不固，風(fēng)寒濕熱之邪乘虛而入，痹阻于肌肉、骨節(jié)、經(jīng)絡(luò)之間，使氣血運(yùn)行不暢導(dǎo)致為痹。麻黃加術(shù)湯出自《金匱要略》，為辛溫解表劑，其藥物組成麻黃（去節(jié)9 g）、桂枝（去皮6 g）、炙甘草（3 g）、杏仁（去皮尖 6 g）、白術(shù)（12 g），具有發(fā)汗解表、散寒祛濕之功效，它不僅可祛除在表的寒濕，亦可祛除在里的寒濕。方中用麻黃祛風(fēng)以發(fā)表，以白術(shù)除濕而固里，且麻黃湯內(nèi)有白術(shù)，則雖發(fā)汗而不至多汗，而白術(shù)得麻黃并可以行表里之濕，即2味足以治病。況又有桂枝和營達(dá)衛(wèi)，助麻黃以發(fā)表；杏仁疏肺降氣，導(dǎo)白術(shù)以宣中；更加甘草協(xié)和表里，使行者行，守者守，并行不悖。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因不明的自身免疫性疾病，在其發(fā)病的過程中，多種細(xì)胞因子、感染因子、細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)及滑膜增生等因素共同參與其免疫病理損傷過程。TNF-α由滑膜細(xì)胞以自分泌和旁分泌的方式表達(dá)，可促進(jìn)前列腺素E2（PGE）等多種炎癥介質(zhì)釋放，趨化炎性細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)滑膜，介導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜產(chǎn)生持久的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損害[4]。IL-1β主要由單核／巨噬細(xì)胞分泌，與RA活動(dòng)性和組織形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)，它通過調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子、免疫調(diào)節(jié)分子及前炎癥介質(zhì)的表達(dá)，在RA滑膜肥大、白細(xì)胞浸潤、骨侵蝕和軟骨破壞中發(fā)揮重要作用[5]。IL-1β與TNF-α常同時(shí)合成和分泌，并且有許多共同的生物學(xué)效應(yīng)。二者稱為“姊妹細(xì)胞因子”，均是致病機(jī)制中居“中心地位”的促炎癥細(xì)胞因子，參與RA發(fā)生、發(fā)展的全過程。許多研究證實(shí)，患者外周血單核細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑膜的巨噬細(xì)胞能分泌IL-1β和TNF-α，使外周血和關(guān)節(jié)滑膜液中的IL-1β和TNF-α含量增高。釋放到關(guān)節(jié)滑膜液及血液中的細(xì)胞因子IL-1β與TNF-α有許多相似的生物學(xué)活性，不但以自分泌的方式刺激巨噬細(xì)胞增加自身的產(chǎn)生，而且也能促進(jìn)對方的合成[6]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麻黃加術(shù)湯能降低TNF-α的水平，從而阻斷炎癥反應(yīng)，延緩RA的進(jìn)展，同時(shí)降低IL-1β的含量，以遏制炎癥的始動(dòng)因素，減輕RA的破壞作用。麻黃加術(shù)湯在CIA大鼠滑膜組織炎癥的病理改變過程中有明顯的抑制作用，對RA的滑膜炎癥有較好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)表明麻黃加術(shù)湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與降低炎性因子IL-1β、TNF-α的水平，抑制炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生和巨噬樣A型細(xì)胞增生有關(guān)。此實(shí)驗(yàn)為麻黃加術(shù)湯臨床上治療RA提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

[1]熊國林，黃海嘯，謝 玲，等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，11（7）：1 690－1 691.

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（本文編輯 彭芝配）

Mmechanism study of Mahuang Jiazhu decoction on rheumatoid arthritis model in rats

XU Qi,YIN Kang-kang,TAN Da-quan,DENG Bing-xiang
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410007， China)

Objective To investigate the mechanism of Mahuang Jia zhu decoction on rheumatoid arthritis.Methods The arthritis models of Wistar rats were stablished by the typeⅡcollagen,the decoction was given to be therapeutic drug,and methotrexate tablets was used as a positive control.The rats were randomly divided into control group,model group,methotrexate group,the decoction group.The serum concentration of inflammatory cytokines IL-1β TNF-α,and the synovial tissue pathology in knee joint was measured.Results The decoction significantly reduced the serum levels of inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α content of synovial(P＜0.01),and inhibited significantly the CIA infiltration ofinflammatory cells,fibroustissue hyperplasia and macrophage-like cells-A significantly(P＜0.01).Conclusion The mechanism of the decoction for rheumatoid arthritis maybe related to reduce the inflammatory factor IL-1β and TNF-α levels,inhibit the inflammatory cells infiltration,fibrous tissue hyperplasia and macrophage-like cell proliferation-A.

Mahuang Jiazhu decoction;rheumatoid arthritis;iL-1β;TNF-α;rats;Chinese ephedra;cassia twig;almond

* 鄧冰湘，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：tb.xinleiren@163.net。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.004.013.03

2010－12－12

湖南省科技廳資助項(xiàng)目（2008SK3071）。

徐 琦（1985-），女，湖南沅江人，在讀碩士研究生，主要從事中醫(yī)病機(jī)與臨床研究。