蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

林 潔 ，賈春燕 ，王若光 ，王 璇 ，肖艷娟 ，葉 贊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2007級研究生班，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2006級研究生班，湖南 長沙 410208）

蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

林 潔1，賈春燕2，王若光3，王 璇4，肖艷娟4，葉 贊4

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2007級研究生班，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2006級研究生班，湖南 長沙 410208）

目的 研究蒲黃黃酮對缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVE-12）活性、內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)含量的影響。方法 缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，MTT比色法觀察蒲黃黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中內(nèi)皮素－1（ET-1）、NO的含量。結(jié)果 蒲黃黃酮可提高缺氧時HUVE-12細(xì)胞活性，減少NO降低程度（P<0.05），抑制ET-1的生成（P<0.05），蒲黃黃酮對HUVE-12細(xì)胞的這種保護(hù)作用與其濃度存在一定的量效關(guān)系。結(jié)論 蒲黃黃酮對缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVE－12具有保護(hù)作用，其作用可能與NO和ET-1的生成有關(guān)。

蒲黃黃酮；血管內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧損傷；保護(hù)性作用

蒲黃，為香蒲科植物（Typhaceae）水燭香蒲、東方香蒲或其它同屬植物的花粉。具有活血化瘀、止血消腫、排膿生肌、通淋等功效。蒲黃歷來為眾多醫(yī)家用來治療婦科疾病如經(jīng)期腹痛，產(chǎn)后出血，產(chǎn)后疼痛，且療效顯著，實為婦科良藥。前期研究中提示蒲黃黃酮具有雌激素樣效應(yīng)，雌激素對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用已經(jīng)證實[1]，故本次實驗利用體外培養(yǎng)的方法來驗證蒲黃黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，探明蒲黃黃酮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制，進(jìn)一步闡明蒲黃的類雌激素效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蒲黃黃酮乙醇提取浸膏，生藥含量為1.6%，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備提供。陽性對照藥17-β雌二醇，由美國Sigma公司提供。

1.1.2 細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVE-12，引自湘雅細(xì)胞中心。

1.1.3 儀器 全自動酶標(biāo)儀（MK3）購自芬蘭LABSYSTEMS集團(tuán)，紫外分光光度儀（UU-754）上海第三分析儀器廠，倒置顯微鏡（XDS-1B）購自重慶光學(xué)儀器廠。

1.1.4 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，購于美國Sigma公司。小牛血清，購自湘雅細(xì)胞中心。二甲基亞砜(DMS0)，購于索萊寶科技有限公司。NO檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），人內(nèi)皮素1（ET-1）ELISA檢測試劑盒（RD）。

1.2 方法

1.2.1 HUVE-12細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVE-12培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，其中含 10%小牛血清，青霉素 100 U／mL，鏈霉素100／mL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按 2.5×104個細(xì)胞／孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待HUVEC-12細(xì)胞生長呈亞融合狀態(tài)時分成6組，分別在不同條件下培養(yǎng)（n=5）即：蒲黃黃酮150μg/mL細(xì)胞組（簡稱高劑量組）、蒲黃黃酮100μg/mL細(xì)胞組（簡稱中劑量組）、蒲黃黃酮50μg/mL細(xì)胞組（簡稱低劑量組）、17-β雌二醇10-8mol/L細(xì)胞組（簡稱陽性對照組）、正常培養(yǎng)細(xì)胞組（簡稱正常組）、缺氧組（單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)細(xì)胞，不加任何藥物干預(yù)）。

1.2.2 缺氧裝置的建立 參照文獻(xiàn)[2－3]的方法，將盛有HUVEC-12細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板放入1個密閉的玻璃干燥器皿中，并在玻璃器皿中點燃1支蠟燭，立即蓋好玻璃器皿蓋，并用凡士林封口，待蠟燭熄滅后將玻璃器皿連同96孔培養(yǎng)板一同放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h。

1.2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性試驗 以MTT法檢測蒲黃黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性。參照文獻(xiàn)[4]，以每孔2.5×104個/mL細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，用DMEM培養(yǎng)液配制成不同濃度的蒲黃黃酮藥液，實驗時棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別向孔中加入不同濃度的藥液200 μL，每個濃度組設(shè)重復(fù)孔5個，空白對照組每孔加入200 μL不含ICA的DMEM培養(yǎng)液。37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前每孔加入MTT(最終濃度0.5 mg／mL)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)4h。棄去上清液，每孔內(nèi)加入DMSO 200 μL，靜置10 min。在酶標(biāo)儀570 nm下測定各孔吸光度值。

1.2.4 內(nèi)皮細(xì)胞抑制率檢測 觀察HUVE-12內(nèi)皮細(xì)胞大體形態(tài)；測定內(nèi)皮細(xì)胞抑制率；檢測NO、ET-1的含量，具體檢測方法參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 蒲黃黃酮對HUVE-12細(xì)胞形態(tài)的影響

正常組HUVE-12細(xì)胞飽滿，大小均勻，胞核較清晰，邊緣清晰，細(xì)胞透亮，呈鋪路石樣緊密排列（見圖1①）。缺氧組的HUVE-12細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞輪廓明顯不清，細(xì)胞膜嚴(yán)重腫脹，細(xì)胞核界限不清，核周圍可見深色顆粒和空泡，視野內(nèi)可見到多處細(xì)胞碎片（見圖1②）。蒲黃黃酮高、中劑量組和陽性對照干預(yù)組細(xì)胞輪廓與正常組比較形態(tài)欠清晰，細(xì)胞核界限欠清，但與單純?nèi)毖踅M比較細(xì)胞腫脹程度輕（見圖1③～⑤）。蒲黃黃酮低劑量組細(xì)胞損傷程度較高、中劑量組嚴(yán)重（見圖1⑥）。

圖1 蒲黃黃酮對缺氧損傷后HUVE-12形態(tài)影響圖（×30）

2.2 蒲黃黃酮對缺氧損傷后HUVE-12的體外毒性影響

經(jīng)MTT法檢測，當(dāng)蒲黃黃酮濃度為150μg/mL時，與正常組相比，細(xì)胞抑制率為1.7%，表明對細(xì)胞無毒性作用，可用于后續(xù)試驗。

2.3 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細(xì)胞活性及NO、ET-1含量的影響

MTT法可反應(yīng)細(xì)胞存活的數(shù)目，缺氧可引起內(nèi)皮細(xì)胞減少，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；蒲黃黃酮能抑制缺氧引起的細(xì)胞數(shù)目減少,低劑量組與缺氧組比較，P＜0.05；缺氧可使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量降低，與正常組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），蒲黃黃酮可減少缺氧時內(nèi)皮細(xì)胞NO的降低程度，低劑量組與缺氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨藥物濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，高劑量組與缺氧組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且蒲黃黃酮各濃度組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明缺氧時HUVE-12細(xì)胞NO的含量與蒲黃黃酮的濃度有一定的依賴性。缺氧時內(nèi)皮細(xì)胞上清液中ET-1的含量升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）,蒲黃黃酮可抑制缺氧時ET-1的分泌，低劑量組與缺氧組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高劑量組與缺氧組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

表1 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細(xì)胞抑制率、NO、ET-1含量的影響 （，n=5）

表1 蒲黃黃酮對缺氧損傷HUVE-12細(xì)胞抑制率、NO、ET-1含量的影響 （，n=5）

注：與正常組比較**P<0.01；與缺氧組比較△P<0.05，△△P<0.01。

組 別正常組缺氧組高劑量組中劑量組低劑量組陽性對照組（E2）藥物劑量（μg/mL）— —150 100 50 10-8mol/L抑制率(%)0 51.100**42.000△△37.700 43.300△36.600△△NO 的濃度（μmol/L）86.363±8.350 34.454±4.446**63.636±4.251△△54.090±7.774 39.090±8.860△62.272±5.230△△ET-1的含量（pg/mL）12.930±2.150 95.880±12.167**47.020±11.647△△61.080±13.275 74.640±15.620△49.700±9.577△△

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）是人體最大、最重要的一種內(nèi)分泌器官，具有重要而廣泛的生物功能，在創(chuàng)傷修復(fù)、血管生成、動脈粥樣硬化等一系列生理病理過程中行使著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，當(dāng)嚴(yán)重感染、缺氧、中毒等時，VEC受損會引起內(nèi)皮功能障礙[5]，本次實驗中，MTT法檢測結(jié)果顯示缺氧可明顯降低HUVE-12的細(xì)胞活性，蒲黃黃酮組和雌二醇組均能提高缺氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，且隨著蒲黃黃酮濃度的變化，細(xì)胞存活率也會發(fā)生相應(yīng)的改變。研究證實MTT比色法檢測蒲黃提取物(藥物濃度100～10 mg/L)對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯的促增殖作用[6]，與本研究結(jié)果相一致。

NO和ET是兩種主要的內(nèi)皮源性血管活性因子，兩者與血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能也密切相關(guān)。NO可擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)血壓，抑制血小板聚集，抗平滑肌細(xì)胞增殖，一氧化氮合酶是NO合成的唯一限速酶。ET-1是已知最強(qiáng)的縮血管和加壓物質(zhì)，血管內(nèi)皮細(xì)胞主要通過調(diào)控ET-1和NO的平衡來調(diào)節(jié)血管的功能。研究表明，缺氧時血管內(nèi)皮細(xì)胞中ET-1mRNA分泌增多[7]。大量臨床研究亦證實缺血性心臟病患者血液中ET含量增加，造成細(xì)胞損害的原因是血漿ET升高可導(dǎo)致鈣通道或磷脂酰肌醇系統(tǒng)的激活，使Ca2+內(nèi)流增加,引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，故血漿ET的含量可在一定程度上反映血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度。離體細(xì)胞實驗也表明，川芎內(nèi)酯A能提高細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、NOS的活性，減少細(xì)胞培養(yǎng)液中ET的活性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞iNOSmRNA和ETmRNA的表達(dá)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保護(hù)心肌的血管內(nèi)皮細(xì)胞[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，17-β雌二醇的抗動脈粥樣硬化作用可能與其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO有關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，17-β雌二醇可以保護(hù)缺氧對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制可能是通過減輕NO的下降程度，抑制ET-1的升高，或是直接抑制ET-1mRNA的表達(dá)，從而降低細(xì)胞的凋亡率實現(xiàn)的[10]。VEC中存在雌激素受體已得到證實[11]，在本次體外實驗中，陽性對照雌二醇組中的NO含量較缺氧組多,ET-1含量較缺氧組明顯降低，這與前面所提結(jié)論相一致。有學(xué)者在蒲黃對高脂黃酮血癥所致內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，蒲黃有提高NO的作用[12]。蒲黃黃酮高、中、低各劑量組亦出現(xiàn)相同情況，在蒲黃黃酮3個劑量組之間，高、中劑量組相對于低劑量組減輕NO降低，抑制ET-1升高的作用要強(qiáng)。而蒲黃黃酮的類雌激素效應(yīng)在課題組前期研究已經(jīng)證實，提示：蒲黃黃酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞同樣具有保護(hù)作用，其作用可能是通過增加NO的濃度，經(jīng)受體介導(dǎo)途徑上調(diào)一氧化氮合成酶（eNOS）的基因表達(dá)，增加eNOS的合成及其活性，抑制了ET-1mRNA的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)NO/ET的平衡，還可能與蒲黃黃酮抗氧化活性以及抗自由基活性，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的負(fù)荷，阻斷ET-1相關(guān)基因表達(dá)，最后發(fā)揮缺氧時對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制目前尚不十分清楚，有待進(jìn)一步從分子、基因水平進(jìn)行研究。

[1]王 璇.蒲黃黃酮雌激素樣效應(yīng)對成年雌性大鼠子宮局部的影響[D].湖南中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.

[2]李珊珊，李 澎，黃啟福.脂多糖對體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能及活力的影響[J].中國病理生理雜志，2001，17(7)：658-661.

[3]Zhang YW,MoritaL shao G.Screeningofanti-hypoxia-rcoxygenation agents by an in vitro model.Part 1：natural inhibitors for protdn tyrosinc activated by hypoxia -rcoxygcnation in cultured human umbilicalvein endothelialcells[J].Planta Med，2000,66(2)：114.

[4]王關(guān)嵩,錢桂生,陳維中.低濃度一氧化碳和缺氧氣體處理培養(yǎng)細(xì)胞容器的研制及其應(yīng)用[J].中國動脈硬化雜志,2001,9(1):67-71.

[5]Grainger D J,Kemp P R,Liu A C,et al.Activation of transforming growt-hfactor-[beta]is inhibited in transgenic apolipopro tein(a)mice[J].Nature，1994,370(6):460-462.

[6]王遠(yuǎn)航,黃文權(quán).MTT法檢測蒲黃提取物對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,4(8):547-552.

[7]周 洪,華大地.低氧對豬肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的ET-1mRNA和Nom和RNA表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志,1993,（9）:309.

[8]高 偉,梁日欣,肖永慶，等.川芎內(nèi)酯A預(yù)處理對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷保護(hù)作用及機(jī)制研究 [J].中國中藥雜志,2007,32(2):133-137.

[9]張嘉晴,周志泳,左保華.蒲黃對高脂血癥所致內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2003,19(3).

[10]陳國棟,吳賽珠.雌激素的抗衰老作用及其機(jī)制研究[J].中國老年學(xué)雜志,2008,3(28):447-449.

[11]Venkov C D,Rankin A B,Vanghan D E,et al.Identification of authentic estrogen receptor in cultured endothelial cells:apotential mechanism for steroid hormone regulation of endothelial function[J].Circulation,1996,（94）:727-733.

[12]張嘉晴,周志泳,左保華.蒲黃對高脂血癥所致內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床,2003,19(3):20-22.

（本文編輯 彭芝配）

Protective effect of Pollen Typhae flavone on anoxia-damaged vascular endothelial cells

LIN Jie,JIA Chun-yan,WANG Ruo-guang,WANG Xuan,XIAO Yan-juan Xiao,YE Zan
（First Affiliated Hospital,TCM University of Hunan，Changsha,Hunan 410007,China）

Objective To study the influences of anoxia on vascular endothelial cells(HUVE-12)activity,endothelin(ET)and nitrogen monoxidum(NO)contents.Methods The damage of vascular endothelial cells was induced by means of anoxia,the action of Pollen Typhae flavone on vascular endothelial cells was measured with MTT chromatometry,and the ET-1 and NO contents with enzyme-linked immunoassay.Results Pollen Typhaeflavone elevated cytoactive of anoxic HUVE-12,reduced NO lowering level（P<0.05） and inhibited ET-1 production（P<0.05）.Conclusion The protective effect of Pollen Typhae flavone exists a protective effect for anoxiadamaged vascular endothelial cells,which maybe related to the generation of NO and ET-1.

Pollen Typhae flavone;vascular endothelial cells;anoxic damage;protective effect

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.05.003.010.03

2011－02－27

湖南省自然科學(xué)基金資助項目（08JJ5030）。

林 潔（1964-），女，廣東蕉嶺人，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，國家第四批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)繼承人，主要從事中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合婦產(chǎn)科學(xué)臨床、科研及教學(xué)。