穴位注射復方丹參液對大鼠跟腱病組織修復的實驗研究

馬 玲，鄭志新，蔣崇博，王 軍

解放軍總醫(yī)院康復醫(yī)學科，北京 100853

跟腱?。╝chilles tendinopathy）是小腿勞損綜合征中最常見的一種，可由跟腱周圍的慢性炎癥、勞損而引起疼痛[1]，與跑步運動有直接關(guān)系，能夠潛在性削減運動能力，是一種處于退變狀態(tài)的病變。跟腱病可導致跟腱斷裂等多種繼發(fā)性損傷，嚴重影響運動能力，越來越被臨床醫(yī)生所重視，因此，對該病進行早期干預十分重要。祖國醫(yī)學在該病治療方面，獨具特色的是運用針灸、中藥在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導下對該病的辨證施治，臨床證明，作為一種獨特治療方法的穴位注射療法，危險性小，并可通過藥物作用以及針灸的活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、解痙止痛等作用而促進病變癥狀的消除和運動能力的恢復。然而這些工作多局限于臨床觀察，針對跟腱病的基礎(chǔ)研究還比較少。本研究以中醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導，用穴位注射復方丹參注射液，探討穴位注射治療跟腱病的作用機制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并且為防治跟腱病提供更為有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物由北京軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供。動物選用健康2月齡雄性SD大鼠60只，體重（217±17）g。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將60只健康2月齡雄性SD大鼠中隨機選取10只設(shè)為空白對照組（Ⅰ組），其余的行跟腱病造模后隨機分為陽性對照組（生理鹽水對照，Ⅱ組）和復方丹參注射液治療組（Ⅲ組），每組各25只。

1.2.2 模型置備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在60只大鼠中隨機選取50只進行造模，具體操作方法：3%戊巴比妥鈉（1.42 ml/kg）腹腔注射麻醉滿意后，大鼠取俯臥位，左小腿備皮，碘伏消毒，鋪洞巾。取左側(cè)跟腱后正中切口，自近端向遠端縱行切開皮膚、皮下組織，切口遠端至跟骨結(jié)節(jié)，近端至小腿三頭肌與跟腱交界處，暴露亮白色的跟腱全段，在直視下使用裝有1%Ⅰ型膠原酶（130 μl/kg）的 30 μl微量注射器，于跟骨結(jié)節(jié)后上緣中點處沿跟腱軸線方向進針平推入跟腱，進針長度為3 mm。間斷縫合切口，并醫(yī)用酒精紗布包扎切口，術(shù)后腹腔注射青霉素（2.7萬U/kg）1次，以預防感染。造模3周后，隨機抽樣處死后確認已建立大鼠跟腱病模型。取其跟腱組織行HE染色光鏡觀察，以證實造模成功。

1.2.3 1%大鼠Ⅰ型膠原酶的制備 用電子秤稱取大鼠Ⅰ型膠原酶粉劑30 mg，置于小燒杯中，向小燒杯中加入生理鹽水3 ml，用玻璃棒攪拌使其溶解，制成1%Ⅰ型膠原酶溶液。整個配制過程均在無菌環(huán)境下完成。將所配制的溶液分裝于EP管并置于-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 取穴及治療

穴位的定位選取根據(jù)林文注等主編的《實驗針灸學》[2]，并以比較解剖和骨度分寸法為依據(jù)。陽陵泉：相當于人體“陽陵泉”的膝下外側(cè)腓骨小頭前下方凹陷處。承山：相當于人體“承山”的腓腸肌兩肌腹分開的下端凹陷處。昆侖：相當于人體“昆侖”足部外踝后方，當外踝尖與跟腱之間凹陷處。

在造模成功后，治療組選取大鼠取俯臥位，左下肢常規(guī)消毒，以配5號針頭的1 ml注射器吸取復方丹參注射液0.3 ml，對大鼠左下肢的陽陵泉、承山、昆侖三穴直刺，深度3～5 mm，回抽無血后，注入復方丹參注射液0.1 ml/穴，用時4～5 s，1次/2 d，10 d為一療程，連治2個月。對照組選用大鼠同樣取陽陵泉、承山、昆侖三穴，注射生理鹽水0.1 ml/穴，1次/2 d，10 d為一療程，連治2個月?？瞻捉M大鼠不予任何干預，正常喂養(yǎng)。

1.4 步態(tài)檢測

將受檢大鼠的雙足底用紅色無毒油泥染色，并將大鼠置于100 cm長、鼠身寬的狹長直通道內(nèi)行走，大約描記出14個足?。ㄗ笥腋?個），從所描記出的左右足的足印中段各選出兩只相鄰足印，然后測量出大鼠雙側(cè)足印的步長、足長、全趾寬和中間趾寬，作為步態(tài)檢測的原始數(shù)據(jù)，留待功能指標換算使用。

1.5 取材和固定

具體方法如下：觀察造模時的切口情況后，將大鼠俯臥位固定于鼠夾上，常規(guī)消毒大鼠培養(yǎng)瓶中小腿皮膚，取自小腿中段至跟骨結(jié)節(jié)的后正中切口，切開皮膚、皮下組織，游離皮膚，保存完整的跟腱周圍組織，暴露整個跟腱，生理鹽水沖洗，用手術(shù)刀自小腿三頭肌與跟腱交界處上方4 mm處橫斷小腿三頭肌，緊貼跟骨結(jié)節(jié)上方橫行切斷跟腱，立即將帶有部分肌肉和完整腱圍組織的全長大鼠跟腱投入裝有10%中性緩沖福爾馬林液（pH=7.2）中常溫固定48 h，以備光鏡觀察和檢測使用，取材完成后，頸椎脫臼處死大鼠。

1.6 標本處理

1.6.1 石蠟切片的制作 將標本從固定液中取出，選材，行常規(guī)乙醇梯度脫水（70%酒精2h→80%酒精3 h→90%酒精3 h→95%酒精過夜→100%酒精3 h），二甲苯透明30 min 2次，56℃浸蠟包埋3 h，所得蠟塊置于4℃冰箱中備用。切片時，使用輪轉(zhuǎn)式切片機4 μm連續(xù)切片，將所得石蠟組織片移入45℃的漂烘儀中，待組織片完全展開后，附貼于載玻片上，裱片后移入37℃孵箱中恒溫過夜烤片，即可行HE染色。

1.6.2 HE染色 ①石蠟切片脫蠟至水：二甲苯10 min 2次，無水酒精5 min 2次，95%酒精、80%酒精、70%酒精各5 min 1次，自來水洗1 min 1次。②染色：蘇木素染液10 min，自來水洗5 min，1%鹽酸酒精10 s，自來水洗5 min，弱堿性水溶液（NH3·H2O，1/500）30 s，自來水洗 10 min，蒸餾水洗 1 次，伊紅染液10 min，自來水洗5 min，蒸餾水洗2次。③脫水、透明、封片：70%酒精 2 min，80%酒精 2 min，95%酒精 2 min，無水酒精5 min 2次，二甲苯2 min 2次，中性樹膠封片。

1.6.3 光鏡下組織學觀察及細胞計數(shù)分析 在640×視野中，對每張切片隨機選取5個視野觀察并記錄造模區(qū)域跟腱組織中成纖維細胞、纖維細胞的數(shù)量以及細胞總數(shù)，取均數(shù)后行統(tǒng)計分析。

1.7 實驗觀察與結(jié)果處理

1.7.1 步態(tài)檢測的數(shù)據(jù)分析 根據(jù)文獻[3-4]中所介紹的方法，結(jié)合步態(tài)檢測的原始數(shù)據(jù)，計算四項步態(tài)指標值：步長差比值（TOFF）、足長差比值（PLF）、全趾寬差比值（TSF）和中間趾寬差比值（ITF），并對各項步態(tài)指標值分別行統(tǒng)計分析。具體計算方法如下：

TOFF（步長差比值）=（實驗側(cè)步長－對照側(cè)步長）/對照側(cè)步長PLF（足長差比值）=（對照側(cè)足長－實驗側(cè)足長）/實驗側(cè)足長TSF（全趾寬差比值）=（實驗側(cè)全趾寬－對照側(cè)全趾寬）/對照側(cè)全趾寬

ITF（中間趾寬差比值）=（實驗側(cè)中間趾寬－對照側(cè)中間趾寬）/對照側(cè)中間趾寬

1.7.2 實驗標本大體觀察 觀察大鼠造模側(cè)小腿皮膚愈合情況，有無發(fā)紅、腫脹等感染表現(xiàn)。觀察跟腱與腱圍組織的形態(tài)、顏色、光澤是否有充血肥厚、有無攣縮、粗大、硬節(jié)、跟腱與腱圍組織之間有無粘連等。

1.7.3 組織學觀察 跟腱細胞數(shù)量和形態(tài)，有無炎癥細胞浸潤，腱纖維組織間有無脂肪組織出現(xiàn)，有無軟骨鈣化，腱圍組織中及小血管周圍有無血管數(shù)量的增加及肥厚，膠原纖維的數(shù)量排列以及結(jié)構(gòu)等。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，統(tǒng)計方法采用平均值的成對樣本分析的t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 步態(tài)檢測的數(shù)據(jù)分析

步態(tài)檢測統(tǒng)計分析結(jié)果，各組間步長差比值中，Ⅱ組與Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.024＜0.05）；Ⅲ組與Ⅰ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.150＞0.05）；各組間足長差比值中，Ⅱ組與Ⅰ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.080＞0.05），Ⅲ組與Ⅰ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.060＞0.05）；各組間全趾寬差比值中，Ⅱ組與Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015＜0.05），Ⅲ組與Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.070＞0.05）；各組間中間趾寬差比值中，Ⅱ組與Ⅰ組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.024＜0.05），Ⅲ組與Ⅰ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.150＞0.05）。 見表 1。

表1 各組步長差、足長差、全趾寬差及中間趾寬差比值的比較（ ±s）

表1 各組步長差、足長差、全趾寬差及中間趾寬差比值的比較（ ±s）

Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組組別 只數(shù) 步長差比值（TOFF）10 25 25 0.003 0±0.000 4-0.123 0±0.003 9 0.026 0±0.003 1足長差比值（PLF）-0.0310±0.0003 0.020 0±0.003 7 0.007 0±0.004 7全趾寬差比值（TSF）0.054 0±0.004 8-0.1420±0.0039 0.070 0±0.004 7中間趾寬差比值（ITF）0.015 0±0.002 9-0.1630±0.0038 0.016 0±0.002 7

2.2 實驗標本大體觀察結(jié)果

Ⅰ組：正常的跟腱組織連續(xù)性好，亮白色，無粗大，無硬節(jié)，無軟化，無攣縮，腱圍組織無充血，無肥厚，跟腱組織與腱圍組織間無粘連。Ⅱ組：皮膚切口瘢痕愈合，無紅，無波動性腫脹，跟腱連續(xù)，顏色暗淡，無光澤，跟腱中段少許增粗，跟腱張力下降，無攣縮，腱圍組織半透明，無明顯充血、肥厚表現(xiàn)，與跟腱組織無粘連。Ⅲ組：皮膚光滑，無色素沉著及可見瘢痕，跟腱連續(xù)性好，亮白色，跟腱較粗，表面無硬結(jié)，張力與正常側(cè)相仿，腱圍無明顯肥厚，與跟腱組織無粘連。

2.3 組織學切片光學顯微鏡觀察結(jié)果

光鏡下HE染色標本組織學觀察顯示，各組均無炎癥細胞浸潤，無腱細胞脂肪化、透明樣變、黏液樣退變、纖維變、腱纖維組織間無脂肪組織出現(xiàn)，無軟骨樣化生或鈣質(zhì)沉著。具體觀察結(jié)果見圖1～3。

Ⅰ組正常跟腱組織（圖1）：細胞少，膠原纖維多，細胞以成熟的纖維細胞為主，細胞核細長，呈嗜堿性染色，個別細胞核為圓形，為成纖維細胞，膠原纖維呈束狀，嗜酸性染色，排列規(guī)則，腱組織內(nèi)毛細血管很少，腱圍組織中有脂肪細胞、纖維細胞和成纖維細胞以及毛細血管。Ⅱ組（圖2）：成纖維細胞多，纖維細胞少，膠原纖維排列紊亂，部分與成纖維細胞一起呈簇狀排列，血管較多，血管周圍無炎癥細胞，部分肌肉細胞核內(nèi)嵌，腱周圍血管無肥厚。Ⅲ組（圖3）：細胞多，排列密集，以成纖維細胞為主，分布均勻，膠原排列整齊，無斷裂，腱組織內(nèi)毛細血管較少，而腱周圍內(nèi)有豐富的血管，細胞豐富，多為成纖維細胞。

2.4 各組中成纖維細胞數(shù)比較

對造模區(qū)域跟腱組織細胞（主要是成纖維細胞）進行顯微鏡下計數(shù)，并行統(tǒng)計檢驗，結(jié)果如下：Ⅲ組與Ⅱ組的成纖維細胞數(shù)明顯多于Ⅰ組，Ⅱ、Ⅲ組與Ⅰ組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P=0.003＜0.01、P=0.028＜0.05），見表 2。

3 討論

3.l 大鼠跟腱病模型的相關(guān)探討

本實驗采用直視下向大鼠跟腱內(nèi)注射1%的大鼠Ⅰ型膠原酶的方法，通過膠原酶對膠原纖維的降解作用從而建立跟腱病的動物模型。大體病理學觀察發(fā)現(xiàn)，造模部分跟腱（跟腱中段）增粗，顏色變暗，張力減低，跟腱表面不平整，局部出現(xiàn)小結(jié)節(jié)；光鏡下組織學觀察發(fā)現(xiàn)，跟腱膠原纖維排列不規(guī)整，甚至斷裂，而且無炎癥細胞表達，自始至終無明顯改變；功能檢測發(fā)現(xiàn)，該造模方法還嚴重影響了大鼠的步態(tài)，整個實驗過程中，TOFF、TSF、PLF、ITF 皆為負值，且每期各步態(tài)指標之間均無差異。在研究該病的病理方面，大多數(shù)研究表明慢性跟腱損傷是退行性改變而無炎性成分，因此更多的學者使用“腱病”這一診斷[5]，由此可見，以上結(jié)果與人體跟腱病的臨床表現(xiàn)及病理檢查所見完全一致，而且并無炎癥證據(jù)，說明該造模方法較好地模擬了人類跟腱病，可用于跟腱病治療的實驗研究。

3.2 步態(tài)檢測功能評價的方法和依據(jù)

步態(tài)檢測能夠綜合而直接地反映出患跟腱病大鼠的踩關(guān)節(jié)功能情況。TOFF、PLF、TSF、ITF這些步態(tài)指標生動地顯示出大鼠跛行程度，當大鼠肢體承受了比較少的重量時，除PLF外其余三項指標都會變小，因此實驗側(cè)數(shù)值減去健側(cè)數(shù)值后所得比值必定為負值。由于當大鼠肢體病殘時其將足平放于地面以休息下肢，所以此時PLF值是增大的，所以健側(cè)數(shù)值減去實驗側(cè)數(shù)值后計算所得比值與其他指標同為負值。本檢測方法使用了比值這一方法，通過健側(cè)與患側(cè)的比較，體現(xiàn)出功能評價的合理性。

3.3 組織學細胞計數(shù)的比較分析

跟腱細胞是一種特殊形式的成纖維細胞（fibroblast），其中功能休止時的成纖維細胞又被稱為纖維細胞（fibrocyte）。成纖維細胞是合成膠原的主要細胞，成纖維細胞合成與分泌膠原能力的增強或成纖維細胞的大量增殖，都可以導致膠原總量的增加。跟腱修復的特征之一是成纖維細胞的增生，在該過程中，休止的纖維細胞可轉(zhuǎn)化為功能活躍的成纖維細胞，從而積極合成和分泌細胞外成分，形成結(jié)締組織的纖維和基質(zhì)。本實驗發(fā)現(xiàn)，各治療組成纖維細胞數(shù)均多于對照組，亦即處于激活狀態(tài)的纖維細胞較對照組明顯為多，從而表現(xiàn)出各治療組跟腱細胞相對旺盛的增殖能力和合成膠原狀態(tài)。

3.4 穴位注射復方丹參注射液的探討

穴位注射治療法是集多種方法（針刺、藥物、經(jīng)絡(luò)）效應(yīng)于一體的復合性治療方法，其機制為多種刺激同時發(fā)揮作用以改善機體微循環(huán)，增強人體的免疫力，達到治療目的[6]，穴位注射又名水針、穴位封閉，是指根據(jù)中醫(yī)辨證施治理論，采用小劑量中藥或西藥注入穴內(nèi)以治療疾病的一種方法。穴位注射將中西醫(yī)兩方面因素結(jié)合起來，兼具中醫(yī)針灸與西醫(yī)注射的特點，是針灸、穴位、經(jīng)絡(luò)和藥物的有機結(jié)合體。該療法以其簡便的操作和顯著而快捷的臨床療效而成為祖國傳統(tǒng)針灸治療方法有效的補充。

本實驗選取了陽陵泉、昆侖、承山三個穴位，行穴位注射復方丹參注射液治療大鼠跟腱病，實驗發(fā)現(xiàn)，丹參在4 μmo1/L濃度條件下對能化后的跨膜電位變化有一定的恢復作用，從而減輕O2-對線粒體的損傷作用[7]，而本實驗Ⅲ組的成纖維細胞數(shù)、細胞總數(shù)均明顯大于陽性對照組，可能與穴位注射復方丹參注射液改善跟腱病腱組織的血供和功能狀況有關(guān)，有研究表明，丹參能促進組織的修復與再生[8]。因此無論從運動功能恢復情況觀察，還是從大體病理改變、組織學細胞計數(shù)、膠原纖維的重新排列等方面的統(tǒng)計結(jié)果看，都取得了顯著的效果，分析原因可能與以下因素有關(guān)：藥物注射入穴位后，因其本身占據(jù)一定空間，故可產(chǎn)生壓力從而刺激腧穴局部，并通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)而發(fā)揮扶正祛邪、疏調(diào)氣血、平衡陰陽等作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，這種刺激可通過神經(jīng)系統(tǒng)，反射性地干預神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而起到防病治病的作用；同時在藥動力學方面，有學者認為穴位注射給藥可使藥物沿經(jīng)絡(luò)到達病所，加速了藥物吸收的進程，減少了藥物作用過程中不必要的“消耗”，現(xiàn)代研究己初步證實了這一觀點，并且實驗表明穴注給藥的藥物潛伏期與靜脈注射給藥相同，而明顯快于肌內(nèi)注射和皮下注射，故其穴位注藥吸收迅速完全，為取得確切、可靠的療效奠定了基礎(chǔ)，同時丹參作為活血化瘀類藥物，具有活血化瘀、行血止痛、去瘀生新之功效[9]，現(xiàn)代藥理學研究顯示，丹參有減輕組織水腫、炎癥、變性壞死，減輕線粒體損傷，加快病灶清除，促進損傷細胞的修復等作用[10-12]。因此，其在跟腱病的恢復方面也起到了重要的治療作用。

4 結(jié)論

穴位注射復方丹參能有效改善跟腱病大鼠步態(tài)，根據(jù)多項指標統(tǒng)計比較并結(jié)合形態(tài)學觀察，應(yīng)用復方丹參注射液對改善跟腱病理學變化、阻止跟腱病的惡化過程，降低軍事訓練傷的發(fā)生和非戰(zhàn)斗性減員有簡便易行防病治病的作用。

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